山羊卵母细胞体成熟培养条件的研究

摘要：从山羊屠宰场收取卵母细胞，置于 39℃、5％CO₂的培养箱中，作24小时体外成熟培养。在含10％犊牛血清（FCS）的成熟培养液里分别添加0％、20％羊新鲜卵泡液，试验结果表明，成熟卵母细胞率分别为54．5％、66.7％，差异不显著。在成熟培养液里添力。不同血清，即10％犊牛血清（FCS）和羊血清（NGS），试验结果表明，成熟卵母细胞率分别为54.5％、65.4％，差异不显著。

关键词： 山羊；卵母细胞；体外；成熟；卵泡液；血清

自1981年以来，各国研究者先后在牛、山羊、绵羊及猪等家畜的体外受精研究方面获得了成功，一些发达国家开始在生产实践中应用，但是，在体外受精有关技术环节中，有许多方面需要进一步改善，首先，卵母细胞的成熟与否对受精及后的发育有很大的影响。体外成熟的卵母细胞发育能力所以低于体内的卵母细胞，是因为体外培养环境未能完全模拟体内相同的生理环境。因此，在体外受精方面，需要进一步研究和改善成熟培养的环境条件，以提高卵母细胞的体外成熟率。

本研究考察了在成熟培养液里添加卵泡液，或添加不同血清的培养效果，以期探讨山羊卵母细胞体外成熟的有效技术途径。

1 材料和方法

1．1卵泡卵母细胞的收集  在山羊屠宰场收集新鲜的山羊卵巢，放入盛有37℃左右加双抗的生理盐水带回实验室（3.5h）。用18G注射针头的注射器从卵巢表面2-5mm卵泡内抽取卵母细胞，然后注入含有2％FCS的TCM～199液的平皿中，在体外显微镜下选择细胞质均匀且紧密围有卵丘细胞的卵母细胞用于成熟培养。

1．2 卵母细胞的成熟培养成熟培养液为：

A液：TCM－199＋10％灭活胎牛血清（FCS）＋HCG（10IU／ml）

B液：TCM－199＋10％灭活母山羊血清（NG）＋HCG（10IU／ml）

C液：A液十20％成熟卵泡液

成熟卵泡液采自直径大于4mm的母山羊成熟卵泡。将各培养液在平皿中制成400ul液滴，上覆石腊油，；置于CO₂培养箱中（39℃、5％CO₂）平衡2小时以上。卵母细胞经 TCM－199（含 2％FCS）组织液洗2次，然后分别移入各试验组作24小时成熟培养。

1.3 卵母细胞体外成熟观察 卵母细胞经24h成熟培养后，用倒置显微镜观察卵母细胞复合体（cumulus oocytescomlex．COC）扩展情况，并将卵母细胞放入1%的柠檬酸溶液，经机械振动除去卵母细胞，然后用酒精一冰醋酸固定24h，用1％的间苯二酚蓝染色，在显微镜下观察其成熟发育情况。细胞质内有显而易见的染色体像时，为卵母细胞成熟分裂的中期Ⅱ（ＭⅡ），此阶段视为卵细胞成熟。

2 结果

2．l  成熟培养液中添加卵泡液对山羊卵母细胞体外成熟的影响

从表1可见，添加20％的成熟泡液其卵母细胞的成熟率为66.7%，略高于不添加成熟卵泡液的成熟率(54．5%)，两者无显著差异。

表1培养液添加卵泡液对山羊卵母细胞体外成熟的影响单位：％

2. 2 成熟培养液中添加不同血清对山羊卵母细胞体外成熟的影响添加胎牛血清和母山羊血清其卵母细胞成熟率分别为 54．5％和 65．4％（见表 2），两组间无显著差异，但是卵母细胞在山羊血清中的成熟率略高于在胎牛血清中的成熟率。

表2培养液里添加不同血清对山羊卵母细胞体外成熟的影响单位：%

3 讨论

据报道（Moor and Trounson），卵泡液中足够的孕酮含量对卵母细胞的成熟具有促进作用。另据Fukur报道，体内卵母细胞的成熟与卵泡液中所含雌激素的量有极大的关系，特别是由雌激素代谢而来的某种有效物质可促进细胞质的成熟。本试验在成熟培养液里添加20%卵泡液，卵母细胞体外培养成熟卵率比未加卵泡液的卵母细胞成熟率高。试验结果表明，卵泡液对卵细胞成熟培养无明显作用。

本试验通过在成熟培养液里添加山羊血（NGS）和犊牛血清（FCS）进行卵母细胞的成熟培养，比较同种动物的血清与不同种动物的血清对成熟培养的影响。试验结果表明，在成熟培养液里添加同种动物的血清其体外培养成熟率为略高于添加犊牛血清的卵母细胞体外成熟率，但无明显作用。

从试验研究结果看出，添加成熟卵泡和同种血清对于提高卵母细胞体外成熟率有作用趋势，需作进一步的探索研究。