1 胚胎移植技术 世界首例牛非手术胚胎移植是1964年日本国家畜牧研究所获得成功的。从那时起,在国家家畜改良育种站(现为“国家家畜改良育种中心”)一直进行着旨在简化该项技术的一系列研究工作,并得到稳步地发展。基于这一研究成果,日本政府从1982年开始实施一项全国范围的“加速胚胎移植技术在农民中推广普及计划”。从事这一技术的单位及胚胎移植生下的牛只数量逐年增加。1992年以来,胚胎牛犊全国每年超过10000头。
1991年,由于政府实行牛肉自由贸易政策,用奶牛或育肥杂种母牛作受体,借助胚胎技术生产日本肉用牛日益俱增。尤其是约60%的受体牛来自农家饲养的奶牛,用来移植日本肉牛胚胎;将高产奶牛胚胎移植大约占20%。1993年,自取消从北国家进口胚胎的禁令以来,移植进口胚胎的母牛数量急剧增加,利用胚胎移植生产的乳用公牛约占已完成后裔测定公牛总数的90%。就奶牛而言,除改良牛群之外,胚胎移植技术的真正利用价值在于生产优秀公牛。
在日本,作为肉牛繁殖和奶牛遗传改良的技术手段,胚胎移植的利用率迅速增长。然而,由于日本农户饲养规模一般较小,新鲜胚胎的移植受到限制。随着移植头数的增加,冷冻胚胎的比例快速增长,目前,冷冻胚胎占总移植头数的80%。虽然移植受胎率逐年提高,但近年来已趋于稳定,鲜胚移植受胎率全国平均达50%,冻胚为40%。
为提高受胎率,国家与地方从事胚胎移植的部门联合攻关,重点解决胚胎移植的基本技术问题,例如:胚胎冷冻保存方法和受体牛的选择等。为保证专业技术水平的提高,国家与地方部门定期为其提供新技术培训,使之成为胚胎移植技术的中坚力量。
胚胎移植是构成胚胎工程中性鉴定、核移植(生产克隆牛)等新技术的基础技术。为加速这些新技术在生产中应用,必须建立一种完善、有效的胚胎移植技术体系,目前,由日本政府资助的各种计划项目已着手实施,以期实现这一宏伟目标。
2 体外受精技术1985年,花田章等人从屠宰母牛的卵巢获取体外受精胚胎,在国家畜牧研究所成功地产下1头试管牛犊。要当时日本的体外受精技术处于世界领先水平。从那时起,作为一种生产日本肉牛胚胎的低成本技术,体外受精就显示出广阔的应用前景。1993年,随着政府有关法律的制定,以商业经营为目的生产与供应体外受精胚胎的诸多私人公司占有主导地位。在日本,肉牛育成母牛通常用来肥育,因为这种育成母牛的胴体价值极高,这就可能从其卵巢上抽取卵母体细胞,再借助体外受精技术,生产成本低品质高的日本肉牛胚胎。目前,体外受精胚胎已开始在农户中移植,由于成本低廉,需求量急剧增加,有时不适宜移植的胚胎也相应地增加,从而造成受胎率的下降。但是,这种情况是暂时的,随着体外受精技术的逐步完善,胚胎的体外生产效率会大大提高,受胎率将稳步上升。此项技术的最新进展,从一个卵巢生产的体外受精胚胎已达3-4枚。然而,仅
根据母牛胴体品质等级,分离其卵巢上的卵母细胞却带来了诸多麻烦,这就导致对某一胚胎的血统资料不甚了解,特别是从一组胴体等级评分很高的日本肉用育成母牛获取的卵巢,可能生产出具有优秀肥育潜力的肉牛胚胎,遗憾的是血统不清楚。按这种方式生产的肉用犊牛,在日本市场上价值并不高,原因是血统不清。因此,除了农户本身生产的肥育牛之外,采用钵外受精技术时,将与育肥牛农户签订合同,以便增加体外受精胚胎移植的犊牛销售量。
与此同时,利用超声波引导法在牛体上采集卵母体外受精生产胚胎,近年来得到发展并逐渐成熟。此项技术已开始在生产中应用,对患繁殖障碍或因老龄无超排反应的高产母牛来说,利用活体采卵技术,无疑可以生产优质胚胎。
3 核移植 核移植是一项将外源全能的细胞核移植入去核的卵母细胞中,以产生遗传上同质性状的克隆牛技术。牛的核移植方法视核供细胞使用的类型来决定,目前,主要采取两种方法:a)分裂到16-32细胞期的早期胚胎细胞;b)来自胚胎内细胞群的具有全能性增殖的胚胎干细胞。利用第一种方法,日本自1990年成功地获得首例核移植牛犊以来,许多研究单位积极以.发展此项技术,并将其应用到实践。使用方法a)即早期胚胎细胞,全国已有150多头核移植牛犊诞生。但是,生产的克隆牛犊数量仍然很低,最多获得过来自同一胚胎细胞的6个核胚胎移植存活1仔,5个核移植胚胎移植存活3仔,3个核移植胚胎移植存活3仔。另一问题是易发生流产和难产现象。此外,采用这和方法生产的20%核移植牛犊比正常牛犊体重偏低。目前,大学与研究单位正在联合攻关,以解决阻碍核移植技术进一步应用的问题。
关于方法b)即采用全能性胚胎干细胞的核移植技术仍处于研究之中,以胚胎干细胞作为核供体细胞有两种途径,一种是从内细胞群细胞中提取1个细胞,另一种是将内细胞再培养后提取1个细胞。据报道,尽管采用前一种方式已获得1头核移核牛犊,但成功率极低。为此,现在很多大学和研究部门正研究建立牛胚胎干细胞生产技术,以便将其应用于核移植技术中,然而,至今尚未成功。
4 性别鉴定 在牛,性别预测可实现最有效的生产管理。对奶牛而言,性别预测能确保高产奶牛生产母犊;已建立起性别鉴定技术程序,即在胚胎移植前,从胚胎上吸取小部分细胞,检测雄性特异DNA,以此鉴定该胚胎的性别。目前,有三家公司联合试制生产专用性别鉴定的检测试剂盒,并向用户销售,该技术已开始在商品市场启动。然而,在成功地应用于生产之前,尚有许多问题,目前,国家与地方研究单位正进行该技术的标准化与简化工作。
日本家畜改良事业团的研究机构已开始实施性别控制技术的研究工作。性别控制技术的基础,是采用流式细胞分类分离“x”与“y”标记物精子的分离技术,在结合体外受精技术的同时,性别控制技术将在养牛业中产生不可佰的影响。