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饲料添加剂VB12含量测定方法的研究

日期：2007-10-16 16:08:00 来源：不详主题：饲料添加剂VB12含量测定方法的研究

    赵小阳料索德成闫惠文田河山虞哲高

    据文献报道，饲料添加剂VB12含量的测定方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法及微生物法。在实际工作中，我们通过对大量样品的检测，发现紫外分光光度法无法排除其他色素、杂质的干扰，不能正确检验评价饲料产品质量;微生物法则测定时间长，检验步骤繁琐;而高效液相色谱法简单、准确和快速，易普及。

    本文主要介绍利用反相高效液相色谱法测定饲料添加剂VB,:含量的实验条件、步骤及效果，该方法适用范围为0.1%-10%各种规格的VB12饲料添加剂，色谱柱为C18柱，流动相所用试剂配比简单，整套方法适用性强。

    1 实验方法

    除特殊说明外，所用试剂均为优级纯，水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T 6682-1992《分析实验室用水规格和试验方法》中一级用水规定，标准溶液和杂质溶液的制备应符合GB/T 602-1988《化学试剂杂质测定用标准溶液的制备》和GB/T603-1988《化学试剂试验方法中所用制剂和制品的制备》的要求。

    1.1试剂和溶液

    25% 乙醇溶液(V/V) ;甲醇:色谱纯;冰乙酸;1一己烷磺酸钠:色谱级;VB12对照品:符合中华人民共和国药典;VB12标准贮备溶液:称取约0.1飞(精确至0.000 2g)VB12对照品，置于100mL棕色容量瓶中，加适量25%乙醇溶液使其溶解，并用

水稀释定容至刻度，摇匀。该标准储备液每毫升含VB12  1.OOmg;VB ,:标准工作液:准确吸取VB12标准贮备液LOOmL于100mL棕色容量瓶中，用水稀释定容至刻度，摇匀。该标准工作液每毫升应含VB12  10μg.

    VB12标准工作液的实际浓度可按下述方法进行测定和计算:

    以水为空白溶液，用紫外分光光度计测定:

    VB12标准工作液在361nm 处的最大吸收度，VB12标准工作液的浓度按式(1)计算:

    1.2仪器和设备

    实验室常用设备;超声波水浴;超纯水装置;紫外分光光度计;石英比色皿(lcm);高效液相色谱仪，带紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)。

    1.3 VB12含量的浏定

    1.3.1原理

    试样中 VB12经水提取后，注人反相色谱柱上，与流动相中离子对试剂形成离子偶化合物，用流动相洗脱分离，外标法计算VB12的含量。

    1.3.2分析步骤

    1.3.2.1试液的制备

    1.3.2.3定量测定

    按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱柱中注人VB1:标准工作液及试样溶液，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量。

    也可采用 GB/T1 7819-1999(维生素预混料中VB12的测定— 高效液相色谱法》中6.2的方法测定VB1:的含量。

    1.3.3 结果计算

    1.3.4重复性

    同一分析者对同一试样同时断两次平行测定，结果的相对偏差应不大于5%.



    2 产品含盘检验方法的确立

    我们收集了一些标示含量为1%的VB12饲料添加剂样品，分别用高效液相色谱法和紫外分光光度法检测样品中VB12的含量，测定数据见表2.

    两种方法检验结果差异较大，有些产品虽然标示VB12含量是1%，用紫外法测定也是1%左右，但是，用色谱法测定VB12含量很低，甚至没有，说明这些产品中不含VB12或者含量很低，属于假冒伪劣产品;还有些1%的产品用紫外法测定，含量达到了2%左右，而用色谱法测定，含量是1%左右，说明这些产品中被有意添加了一些能干扰紫外法测定结果的非VB12物质，使测定值高于真实值，也属于假冒伪劣产品。根据两种方法测定原理可知，紫外法无法排除其他色素干扰，而高效液相色谱法分离效果好、可排除杂质干扰，用色谱法检测产品含量，更接近产品真实值、结果更准确。

    3 色谱条件的选择

    在国家标准GBIT1 7819-1999《维生素预混料中VB12的测定一高效液相色谱法》中，色谱柱选用NHZ柱，流动相为0.3%正磷酸水溶液十乙睛(240+760)，考虑到C18柱成本低、较普及、分离好，流动相为每升水溶液中含300mL的甲醇,1g的己烷磺酸钠和lOm L的冰醋酸，配比简单，因此本方法规定可选用C18柱和.NH:柱两种色谱柱进行分离测定。我们选用不同厂家的产品分别用NH，柱和C18柱进行分离测定，测定结果见表3.

4 VB12不同浓度标准溶液与峰面积响应值线性关系

    5 方法回收率《准确度)

    由于各生产厂家生产的VB12饲料添加剂所用的稀释剂不同，有玉米淀粉和碳酸钙两种稀释剂，用添加量回收率方法考查方法回收率。每种稀释剂按照1%,5%两种规格检验回收率。1%规格:称取O.lg稀释剂于100mL棕色容量瓶中，准确加人浓度为l.O mg/mLVB ,z对照品溶液LOOmL,上机浓度为l0FLg/mL;5% 规格:称取0.05g稀释剂于100mL棕色容量瓶中，准确加人浓度为5.0m留mLVB,:对照品溶液0.5mL，上机浓度为25} L g/ mL 。放置一段时间，按照本方法提取，上机测定，测定结果见表5。

    测定结果表明，本方法的回收率在90%-105%之间，本方法有较好的准确度。

    6 方法精密度(重复性)

    选取同一批VB12饲料添加剂，按照本方法确定的条件进行5次重复实验，测定饲料添加剂VB12的含量。结果发现，对于同一样品，其CV为0.5%，说明本方法有较好的精密度、重复性。

    7 不同厂家生产的VB,:饲料添加剂测定结果与标示量对比

    选取不同厂家不同批号的产品，按照本方法确定的实验条件进行含量的测定，其结果见表6。