芽孢杆菌植酸酶研究进展

四川农业大学动物科技学院  王红宁

有关植酸酶的研究，目前较多的是微生物产  生的植酸酶，对其进行的分离纯化及理化性质研究表明，它们可能是饲用植酸酶的最佳来源。其中以对真菌的酸性植酸酶研究最多，目前已构建各种基因工程菌并得到高效表达，进行了大规模的发酵生产，大大提高了酶产量和降低了生产成本。由于酸性植酸酶其酶促反应的pH有效作用范围在2．5～5．5之间，因此主要应用于胃pH值呈酸性的单胃动物及少数鱼类如虹鳟等，而不适合用于消化道呈中性的鲤科鱼类，以及在单胃动物pH值呈中性的肠道段中表现酶活力，限制了酸性植酸酶的应用范围。研究表明，来源于芽孢杆菌的植酸酶属于中性植酸酶（3－Phytase，EC 3．1．3．8），不仅具有较好的热稳定性，有助于抵抗饲料制粒或者膨化过程中高温引起的酶失活，而且其酶促反应的pH有效作用范围在7．0～7．5之间，可以有效弥补酸性植酸酶的不足。此外，有的芽孢杆菌（Bacillus wtfolfywt。）所具有的胞外植酸酶活性，对在磷酸限制条件下的植物具有促生长作用。

1  产植酸酶芽孢杆菌的分离

芽孢杆菌可以抱子的形式存活，适应外环境能力强，广泛存在于自然界中，以土壤中分布最多。由于芽孢杆菌可在45～55℃温度下生长，其拖子也具有较强的耐热性，因此在初次分离芽孢杆菌时，一般都对样品采用热处理的方法，将其他大部分杂菌杀灭。具体方法是，将生理盐水或蒸馏水浸泡的样品80℃水治处理 10～15 min，或沸水浴中处理5min。然后取热处理后的浸液0．lmL与50℃左右的营养琼脂培养基在平板混合后，28～30℃需氧培养24～48 h。将营养平板上的单菌落点种到含有植酸钙（钠）的植酸酶筛选培养基上，28℃培养3～5 d，观察是否产生透明消解圈。由于有些细菌可能产生多量的酸性代谢产物，也可使筛选培养基出现透明的消解圈，引起假阳性的出现，因此必须将产生透明消解圈的菌株经产酶培养基培养后，取培养液在中性条件下进行植酸酶活性的测定，并进一步镜检和生化鉴定。目前已分离出多种产植酸酶芽孢杆菌（Bacillus），主要是枯草芽抱杆菌（B．subtilis），其他有地衣芽  抱杆菌（B．lichenofonnis）、淀粉液化芽抱杆菌（B．amfolfyuefacic。）及其变种（ Bacill. sp．）等。

由于产植酸酶芽孢杆菌分离来源的木同，所  属种也不尽相同，因此其植酸酶的产酶特性有所差异。Powar等（1982）从土壤中分离的B．Subtilis2712菌株的产酶诱导试验表明：在以葡萄糖十酪蛋白、淀粉十酪蛋白为碳源的培养基中没有植酸酶产生，即使添加肌醇也不能诱导其产生，而植酸盐。酵母浸膏或麦茨浸液（均含有植酸盐）可诱导植酸酶的产生，将以上3种诱导物中的任何一种添加到以麦芽糖和淀粉为碳源的培养基中可产生植酸酶。在以酪蛋白水解物为主要氮源的培养基中，24 h内就可检测到植酸酶显著产生，并于72 h达到酶活高峰。 Mikio Shindzu（1992）从日本传统水豆鼓中分离的B．Ubtilis N-77菌株，在含有10nunl CaCI₂· 2H₂O、 l％葡萄糖、 l％ D一甘露糖和0．5％酵母浸膏的心脏浸剂（HI）肉场中37 ℃需氧培养 5 d后达到植酸酶最高酶活，表明 Ca²⁺和D一甘露糖能很强地刺激植酸酶产生，其最适浓度分别为5 mmol和 1％。 Young－Ok kim等（1998）从牛场附近的土壤中分离的Bacdlus sp．DSll菌株，在含有麦麸和酪蛋白水解物的产酶培养基中培养24 h达到植酸酶酶活高峰。 Janne Kerovuo等（1998）从菌种库中筛选的B．Subtilis VTT E－68013菌株，在麦麸培养基中培养 50 h达到植酸酶最高酶活，该菌株的产酶诱导试验表明，植酸盐并不能诱导植酸酶产生，而是抑制细菌蛋白的表达。虽然含有无机磷酸盐的M9基础培养基与植酸盐一样不能诱导植酸酶产生，但在以植酸盐为唯一磷酸盐来源的培养基（如植酸酶筛选培养基）却可诱导植酸酶的分泌，而且含有比LB肉汤更少无机磷酸盐的马铃薯一葡聚糖培养基也可诱导植酸酶的产生。这些研究表明，植酸酶的产生受无机磷酸盐的抑制，磷酸饥饿可诱导植酸酶的产生。基于此，Janne Kerovuo等（1998）运用了一种新的芽抱杆菌表达系统，该系统与磷酸盐运输相关的pst操纵子对磷酸饥饿反应具有强烈诱导作用。作为磷酸饥饿的结果，由pst启动子引发的表达可被诱导至5000倍以上，为芽孢杆菌植酸酶的高效表达提供了有效途径。

2    芽孢杆菌植酸酶酶活测定方法

目前文献报道的测定芽孢杆菌植酸酶酶活的方法主要有以下 4种： l）Vishnu Powr等（1982）报道，反应液中含有 200 μmol Tris－HCI、1μmol Ca一CI₂0.67μmol植酸钠问当于4μmol植酸磷）以及酶液，共2 mL，pH 7．5，30℃培育 10 min后加入 2mL 10 ％三氯乙酸终止反应，测定释放出的无机磷。一个植酸酶活力单位为：在此测定条件下，每分钟从植酸钠溶液中释放1μmol无机磷所需要的酶量。 2）Mikio Shindzu（1992）、Janne Kerovuo(1998)和王亚茹等（2001）报道， 150μL酶液十600  2mmol／L植酸钠、0．lmol／L Tris－ HCI（pH7．0）、2mmol CaCI₂，37℃水浴15～30 min，加 750μL5％三氯乙酸（TCA）终止反应。加入1．5mL显色液（4：1＝1．5％铅酸氨、5．5％硫酸：2．7％硫酸亚铁），生成的磷铅酸盐在700 nm下测定 OD值。一个植酸酶活力单位为：在此测定条件下，每分钟从植酸钠溶液中释放lμmol无机磷所需要的酶量。 3)Young－Oh Kim等（1998）报道，100μmol 酶液十400μL 2 mmol／L植酸钠、0．lmol／L Tris－HCI(pH 7．0)、2mmol CaCI₂，37℃水浴 30 min，加500μL 15％三氯乙酸终止反应。加入4 mL显色液（1：1：2＝6：1／L硫酸：2．5％钼酸氨:10％抗坏血酸：水）37℃水浴30 min，生成的磷银酸盐在820 nm下测定 OD值。一个植酸酶活力单位为：在此测定条件下，每分钟从植酸钠溶液中释放lμmol无机磷所需要的酶量。4）符勇、王红宁等（2003）报道，0．5mL酶液十l.5 mL 0．lmol／L Tris－  HCI（pH 7．5）、2 mmol  CaCI₂， 37℃预热  5 min；加4 mL 2 mmol／L植酸钠对、0.lmol／L Tris－ HCI（pH7． 5）、2mmol  CaCI₂， 37℃水浴 30 min；加 4 mL显色液（100 g／L钼酸氨 250 mL＋ 2．35 g／L钒酸氨 250mL＋ 65 ％纯硝酸  165 mL，用水补充至  1000 mL），生成的磷铅酸盐在415 nm下测定OD值。一个植酸酶活力单位为：在此测定条件下，每分钟从植酸钠溶液中释放Immol无机磷所需要的酶量。

以上4种方法虽然都可以用于芽孢杆菌植酸酶酶活的测定，但由于使用试剂和显色反应的不同，对测定结果有一定的影响，进而影响不同方法测定的酶活力大小的可比性。因此，有必要对这4种测定植酸酶的方法进行对比试验，以确定测定的差异，并建立一种标准和通用的测定方法。

3  芽孢杆菌植酸酶的纯化

已报道的有关芽孢杆菌植酸酶的具体纯化方法各不相同，基本上都考虑到以下3点：l）芽孢杆菌植酸酶分泌能力较低，分离纯化必须对大量培养液进行高度浓缩；2）纯化过程基本上都控制在0～4℃进行；3）芽孢杆菌植酸酶的酶活对钙离子具有特异的依赖性，因此使用的所有缓冲液中都应有一定浓度的CaCI₂。

据报道，具体纯化方法为：1）Vishnu K．Powar等（1982）报道，将预冷的乙醇沉淀培养液中的酶蛋白沉淀清洗后，在含有P₂O₅和固体石蜡的容器里0℃真空干燥。获得的酶干粉经醋酸缓冲液浸提后，用预冷的丙酮再次沉淀。清洗沉淀，用醋酸缓冲液再次浸提后透析24h，然后将酶溶液吸附在离子交换树脂（Amberlite IRP－64）上洗脱。活性洗脱液冻干浓缩后透析，重复一次。酶液过二乙胺乙基纤维素层析柱（DEAE－cellulose柱），收集活性洗脱液，浓缩透析后即得纯酶。其总回收率为32 ％，纯化倍数为39. 2）Mikio Shimizu

（1992）报道，由于植酸酶具有较高的热稳定性，以下步骤均在室温下进行。培养液通过 DiaflO YM3膜超滤，浓缩50倍。浓缩后的滤液过 Sephadex G～100柱，活性洗脱液超滤浓缩。将酶液再次过Sephadex G～11柱，活性洗脱液超滤浓缩。将酶液过DEAE－Sopharose CL-6B柱，活性洗脱液超滤浓缩。将酶液第3次过Senhadex G～100柱，活性洗脱液超滤浓缩，即得纯酶。其总回收率为14．6％，纯化倍数为 322．2。 3）Janne Kempo等（1998）报道，将预冷的乙醇沉淀培养液中的酶蛋白沉淀清洗后，在氮气流中蒸发后冻干，再溶解。酶溶液经 65％和 85％饱和度的（NH₄）₂SO₄处理，沉淀后再溶解。酶溶液过PD～10胶过滤柱，洗脱后用单向高效液相色谱（HP－HPLC）柱纯化，并用含有浓度呈线性梯度的乙睛的三氟乙酸溶液洗脱，活性洗脱液冷冻干燥，再溶解。其总回收率为22 ％，纯化倍数为78．73 4）Young－OK Kim等（1998）报道，将预冷的乙醇沉淀培养液中的酶蛋白沉淀经 TriS－ HCI（pH 7．0）浸提后，加入固体(NH₄）₂SO₄至终浓度为 1．5 mol／L。酶溶液过苯基琼脂糖凝胶（Phenyl Sephosc）柱层析，用线性下降梯度的（NH₄）₂SO₄洗脱。活性洗脱液透析后，转入Resouoe S柱，用含0～0．5 mo／L线性梯度的NaCI缓冲液洗脱。活性洗脱液透析后，将酶液通过Superose 12 HR 10／30柱作最后纯化，收集活性组分，用bacon PM 10膜经超滤浓缩。其总回收率为 10％，纯化倍数为对。 5）王亚茹等（2001）报道，将预冷的乙醇沉淀培养液中的酶蛋白沉淀清洗后。酶溶液经65％和85％饱和度的(NH₄）₂SO₄处理后，沉淀再溶解。酶溶液首先经HIPrep－26／10一脱盐柱脱盐，然后用离子交换柱Hitrip－SP－Sepgmse－XL分离，收集的活性洗脱液再用凝胶柱Sllperdex－75－HR－10／30纯化，收集活性洗脱液即为纯酶。其总回收率为18 ％，纯化倍数为1000。

4  芽孢杆菌植酸酶的酶学特性

4．l  芽孢杆菌植酸酶的一般酶学性质  各种芽抱杆菌植酸酶的酶学性质基本一致，具有相近的分子量和等电点，都具有较高的热稳定性，最适pH值均在7左右。它们对植酸钠的Km值（Inlnol）以及底物特异性却存在一定差异，可能是因来源不同而在酶蛋白细微结构上存在差异所致。

4．2  芽孢杆菌植酸酶的热稳定性  芽抱杆菌植酸酶具有比真菌来源和大肠杆菌来源植酸酶更好的热稳定性。 YOung－OK kim等（1998）报道的芽孢杆菌  B． sp． DSll植酸酶在 90℃处理  10  min后酶活可保留 50 ％。 Janne Kerovuo等（1998）研究表明，枯草芽孢杆菌植酸酶在smrnl Ca²⁺溶液60℃培育 10 min后保留酶活 90％以上，若没有 Cd²⁺

存在则无酶活，在 Ca²⁺溶液 100℃培育 10 min 保留酶活 20％。他们的研究表明，只有在 Ca²⁺的存在下，植酸酶才有热稳定性，而且在热诱导的变性后植酸酶才可部分复性。可见无 Ca²⁺的植酸酶热变性是不可逆的， Ca²⁺对植酸酶的三维结构具有稳定作用。

4．3  芽孢杆菌植酸酶对钙离子的依赖性芽孢杆菌植酸酶的酶学性质与真菌植酸酶有所不同，如乙二胶四醋酸（EDTA）等螫合剂很容易使芽抱杆菌植酸酶失活，而EDTA却是真菌植酸酶的激活剂。特别是芽孢杆菌植酸酶的活性有赖于金属离子的存在。去除了钙离子的芽孢杆菌植酸酶脱辅基酶与相同浓度的各种二价阳性离子（Ca²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、 Mn²⁺、 Co²⁺、 Mg²⁺、 Cu²⁺）的氯化物室温培育过夜，结果表明只有钙离子可以部分恢复植酸酶的活性，即恢复了植酸酶酶活的这种脱辅基酶与金属离子之间的相互作用具有离子特异性。钙离子对芽孢杆菌植酸酶至关重要。首先，酶活性可被诸如 EDTA等螯合剂完全抑制（只要其摩尔浓度超过钙离于浓度），引起酶抑制最大可能的原因是从酶中移除了Ca²⁺。只要再加入Ca²⁺，酶蛋白可明显地重新表现活性，而再加入其他金属离子则不能或者只能部分替代 Ca²⁺而形成有活性的酶。Ca²⁺浓度超过植酸浓度时则引起酶的抑制。因此，含有饱和了 Ca²⁺的磷酸根离子的植酸盐不能作为此酶的底物。其次，植酸酶的全酶、脱辅基酶和钙重新激活酶的圆二色光谱（ CD光谱），揭示了   Ca²⁺在蛋白构造中的局部作用。试验结果表明，培育在有 Ca²⁺的环境中，失活酶蛋白的结构变化仅仅是使部分酶蛋白重新折叠而成为有活性的结构。业已证明，无论在有钙还是无钙情况下，芽孢杆菌植酸酶对木瓜蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶都具有很强的抵抗力，即使在这些高浓度的蛋白酶作用后仍可保留 11％的酶活。然而，无论Ca²⁺存在与否，植酸酶却对胃蛋白酶相当敏感，这种敏感性可能是在低pH值条件下植酸酶更容易变性的结果。

5  芽孢杆菌植酸酶的催化机理

综上所述，芽孢杆菌植酸酶是一类中性植酸酶，具有良好的热稳定性，其稳定性和活性对钙离子具有强烈的依赖性，表现出和其他植酸酶不同的催化机理，是一类新的植酸酶。加快利用现代生物技术对中性植酸酶进行研究与开发，使我国能自行生产成本低廉的中性植酸酶，对缓解磷资源缺乏，降低饲料成本，减少磷对环境的污染，具有良好的经济效益和生态环境效益。