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吐温80作为新型饲料添加剂对反刍动物瘤胃生态和生产性能的影响
日期：2006-4-13 11:05:00 来源：河南畜牧网 主题：吐温80作为新型饲料添加剂对反刍动物瘤胃生态和生产性能的影响
作者：邓卫东，… 文章来源：饲料工业
摘 要 添加吐温80在500ml混合瘤胃微生物培养物内的浓度分别为0.00％、0.05％和0.10％时，羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶和大麦葡聚糖酶等胞外酶的总产量会显著提高（P<0.05），不过胞外和胞内果胶酶的总产量不受影响。同时，木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶和葡聚糖酶等酶的活性由于有更多的酶从结合形式变为游离形式而升高。非离子表面活性剂（NIS）对瘤胃微生物的生长也有影响。添加吐温80能显著促进瘤胃内非纤维素分解菌的生长速度，而对纤维分解菌的生长影响不大。添加0.05％的吐温80对瘤胃微生物的生长促进最大。添加吐温80还能显著增加瘤胃内真菌和原虫的数量。灌注吐温80也能增加瘤胃pH值、氨氮和总挥发性脂肪酸浓度，从而提高干物质降解率及奶牛产奶量。非离子型表面活性剂对瘤胃的作用机理至少可归结为两方面原因：①增加酶的释放量和（或）增强酶的活性；②促进酶和底物之间的相互作用。尽管一些报道NIS对瘤胃微生物和瘤胃发酵特征有负作用，研究表明NIS还是可能成为一种新型饲料添加剂能够安全、简便地应用于反刍动物来调控粗饲料条件下瘤胃发酵而提高饲料营养价值和生产性能。
反刍动物由于能依靠人类所不能食用的粗饲料而生产大量的蛋白质满足人类日益增长的需要，从而体现出巨大的优越性。同时，我们应该认识到，反刍动物粗饲料（特别是秸秆类）由于纤维含量高导致低的营养价值（Liyama和Lam，2001），特别是在热带地区(Santra和Karim，2003)。同时饲料成本在奶牛生产中大约占70％（Nagaraja，1997），因此，对于小农户和奶牛养殖户来说，最大限度的提高营养物质的消化率意味着获得更多的利润和保持养殖业的可持续发展。目前已有相当多的方法通过调控瘤胃内环境以提高饲料利用率和反刍动物生产效率，从而满足日益增长的人口和提高生活水平的需要。结果导致种类众多的饲料添加剂运用于调控瘤胃发酵。在过去的几十年中，调控瘤胃的饲料添加剂主要有甲烷抑制剂、抗生素、蛋白酶和（或）脱氨基抑制剂、去原虫剂、微生物酶、添加脂肪或脂肪酸、缓冲剂或人工唾液、离子载体、益生素和非细菌直接饲用微生物包括酵母及其提取物（Lee等，2004）。然而，这些添加剂及使用方法必须简单有效、有利可图、容易接受等（Perston和Leng，1987）。一个潜在的方法就是通过增加纤维酶的数量或活性提高粗饲料的消化率。在这方面已有大量的报道，但是瘤胃微生物本身就能合成这类酶，因此如何提高内源酶的活力，也是一个相对简单的方法，有殊途同归之功效。非离子型表面活性剂早已认为是一类有效的表面活性剂，可以刺激需氧微生物释放酶，然而有关对厌氧微生物的影响还不是很清楚。因此本人综述了近年来新型饲料添加剂吐温80对瘤胃微生物、瘤胃生态及消化率、生产性能的影响，并分析了其作用机制。
1 表面活性剂分类
表面活性剂是当以低浓度添加到液体中时，改变了液体的表面或内在特性。可以分为阳离子型、阴离子型、阴阳离子型和非离子型4大类。文中的2种非离子型表面活性剂的基本特征见表1。
吐温80（Tween80），化学名称为聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。外观为浅黄色液体。最大酸值、皂化值和亲水亲油平衡值分别为2mg KOH/g，40～55mg KOH/g 和14.9（Myers，1992；Porter，1994；Kamande et al.,2000； Lee et al., 2003a）。
2 表面活性剂的理化特征
表面活性剂最明显的理化特征是它们的界面活性——当置于溶液时移居于液相交界处。表面活性剂在界面的排列是它们有非常强的方向性倾向的反映。表面活性剂通常根据两方面分类：①亲水部分（头部）的性质及其是否带电；②疏水部分的柔韧性或化学特性。头部可能是阴离子、两性离子、非离子及阳离子型。表面活性剂的亲水、亲油平衡值（HLB）很大程度上决定于其物化特性（Myers，1992；Porter，1994；Kamande，2000）。
3 吐温80对酶分布和酶活力的影响
瘤胃是一个复杂的厌氧发酵罐，瘤胃微生物存在于液相、固相和气相中(Cheng 和 Mcallister，1988)。主要存在于液相和附着于饲料颗粒上。瘤胃微生物主要可以分为两类：非附着型微生物（存在于液相）和附着型微生物（附着于颗粒）。Willams和Strachan (1984)从瘤胃食糜和液体中检测多糖降解酶的分布和活力时发现，尽管都能检测到其酶的分布，但高活性的植物结构多糖降解酶附着于饲料颗粒，而溶解性多糖降解酶则存在于液体和非附着部分（Williams 和 Strachan，1984 Williams，1984）。因此酶的分布影响着瘤胃对饲料的降解。
为研究非离子型表面活性剂对瘤胃酶的分布和活性的影响，Lee等（2003）报道吐温80添加到500 ml混合瘤胃微生物培养物中的最终浓度分别为0.00%、0.05%和0.10%对上清液（胞外酶）和细胞结合酶（胞内酶）的产量和活性的影响（见表2）。孵育3h 后，发现添加0.05%和0.10%吐温80显著提高胞外羧甲基纤维素酶（CMCase）和木聚糖酶活力（P<0.01)，显著降低胞内羧甲基纤维素酶和木聚糖酶活力(P<0.01)，其它胞外酶如蛋白酶、淀粉酶和大麦葡聚糖酶活性也显著提高（P<0.01)。其中提高幅度最大的是大麦葡聚糖酶，添加0.05%和0.10%吐温80分别提高了223％（从502 IU增加到1 151 IU）和221％（从463 IU增加到1 024 IU）。但对果胶酶没有影响（P>0.05)。同时该研究还指出，纤维素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶主要以胞内酶形式存在，而淀粉酶和蛋白酶主要以胞外酶形式存在。Weimer等（1990）指出，在瘤胃饲料消化方面，胞外酶比胞内酶更重要。但并不是增加瘤胃内酶活力都是有益的，增加蛋白水解酶活力将减少过瘤胃蛋白的数量，从而减少在小肠消化和吸收的氨基酸的数量和质量。
关于添加非离子型表面活性剂对酶活力的影响，Kim等（1982）报道了添加吐温80提高了发酵系统内纤维素酶的活力。Kamande等（2000）报道了添加吐温80（从0.0%到2.0%，10个浓度梯度，0.2/梯度）于混合瘤胃微生物中孵育2h后测定微生物酶活力，发现随着吐温80浓度的增加，蛋白酶和纤维素酶活力线性增加，添加吐温80蛋白酶的最大速度（从米氏方程计算出的）为166.8％，而达到最大速度50％的浓度为0.20％。此外，McAllister（2000）报道添加吐温80提高了体外纤维素酶活力。而Lee等（2003a）试验显示，每天向韩国本地奶牛瘤胃灌注100 ml 吐温80（吐温在瘤胃的浓度计算为0.05%）2次，显著提高了木聚糖酶活力（P<0.01），特别是在饲喂后3h和9h，而羧甲基纤维素酶活力在饲喂后6h和9h有所提高。Lee等（1998a，2003b）报道添加0.05％吐温80于大麦培养基上培养30h后，与对照组相比，显著增加了纤维素酶（90.01%）、木聚糖酶（90.73%）和淀粉酶（487.25%）的活力（P<0.05），添加0.05%吐温80于鸭茅培养72h后，也显著提高了纤维素酶（124.43%）、木聚糖酶（108.86%）和淀粉酶（271.22%）的活力（P<0.05）。对瘤胃微生物混合培养物添加0.10％的吐温80，在孵育阶段也能观察到这些酶活性的升高。
上述结果表明非离子型表面活性剂能提高瘤胃或混合厌氧瘤胃微生物内的多种酶活力。但是，Hristov等（2000）报道，10头体重（484 ± 55）kg娟姗牛饲喂70％大麦和30％苜蓿（干物质基础），随机分为对照组（不使用吐温80）和试验组（添加吐温80，2g/kg 干物质采食量），瘤胃羧甲基纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶没有显著差异（P>0.05）。此后，Hristov等（2000）采用体外法又比较了包括吐温80（浓度为0.00%、0.05％、0.10%和0.20%）在内的14种饲料添加剂对瘤胃发酵和原虫数量的影响，发现吐温80仅显著降低了淀粉酶活力（P<0.05），而对羧甲基纤维素酶、木聚糖酶和脱氨酶活力影响不显著。上述差异也可能是由于添加剂的剂量、孵育时间和采样时间不同等原因造成的。
4 吐温80对瘤胃微生物生长的影响
4.1 吐温80对瘤胃细菌的影响
已有非离子型表面活性剂能增加微生物总数（Kim等，1982）和瘤胃细菌产量的报道（Kamande等，1993）。Lee等（1998b，2003a）进一步研究了非离子型表面活性剂对体外培养瘤胃纤维分解菌和非纤维分解菌纯菌株的影响。纤维分解菌包括产琥珀酸丝状杆菌S85、白色瘤胃球菌8、黄化瘤胃球菌FD1和溶纤维丁酸弧菌A46，非纤维分解菌包括嗜淀粉瘤胃杆菌H-18、埃氏巨球形菌B159、栖瘤胃普雷沃氏菌23和月形单胞菌S23。吐温80添加到试管的最后浓度为0.00%、0.05%和0.10%。结果发现添加吐温80显著刺激了4种非纤维菌菌株的生长速度（P<0.05），同时最有效浓度为0.05％。当测定孵育8h后4种纤维分解菌纯菌株的生长速度时发现，添加0.05％吐温80刺激了产琥珀酸丝状杆菌的生长，该菌被认为是降解植物组织的最有效的菌株（Miller，1959），添加0.10％吐温80也刺激了产琥珀酸丝状杆菌的生长，并且在很大程度上超过了添加0.05％的吐温80，但这2个浓度之间差异不显著。总体来说，添加吐温80刺激非纤维分解菌生长的效果要好于纤维分解菌。在测试的8种菌株中，只有瘤胃球菌属（白色瘤胃球菌和黄化瘤胃球菌）是革兰氏阴性菌，并且对添加吐温80没有反应，而另外的6种菌都属于革兰氏阳性菌。因此，可以初步认为吐温80的效果：革兰氏阴性菌要比阳性菌好，非纤维分解菌比纤维分解菌好。
然而，并不是所有的研究结果都表现出正效应。Hristov 等（2000）报道使用吐温80并没有显著影响乳酸菌数量（P>0.05），但Hristov 等（2003）试验显示，当用15N标记酪蛋白作为示踪物时，与对照组相比，0.05%吐温处理没有显著提高15N标记的细菌数（P>0.05），而0.10%和0.20%吐温处理显著提高了细菌总数（P<0.05）。
4.2 吐温80对瘤胃真菌的影响
Lee等（1998b，2003a）报道了吐温80对单中心真菌Neocallimastix patriciarum strain 27， Piromyces communis strain 22和多中心真菌Orpiomyces joyonii strain 19-2，Anaeromyces mucronatusch纯菌的影响。基于细胞蛋白质含量，添加0.05％的吐温80，显著提高了单中心真菌的生长速度（P<0.05）；相反，0.10％吐温80却抑制了单中心真菌的生长速度，尽管仅对P. communis的抑制效果呈显性。添加各种浓度的吐温80都能显著提高多中心真菌O.joyonii 和 A. mucronatus的生长速度（P<0.05）。当添加0.05％的吐温80能促进单中心真菌的生长，而当剂量为0.10％时却对单中心真菌生长产生抑制。这些结果表明，吐温80不仅对真菌有促进营养作用，而当剂量较高时也会对其生长产生一些毒副作用（Lee等，1998b、2003a）。
4.3 非离子型表面活性剂对瘤胃原虫的影响
非离子表面活性剂对原虫影响的研究较少。Hristov等（2000）研究报道，添加吐温80与对照组相比，瘤胃原虫的数量差异不显著（P>0.05）。随后，Hristov等（2003）又对吐温80分为0.00％、0.05％、0.10％和0.20％ 4个不同剂量添加进行比较，也发现添加吐温80对原虫的数量没有影响，不过添加0.10％和0.20％的剂量能提高原虫利用细菌氮源的比例。
5 吐温80对瘤胃发酵特征的影响
Lee等（2003a）研究了吐温80对瘤胃发酵特征的影响。他发现灌注100ml吐温80溶液（70ml蒸馏水和30ml吐温80溶液，灌注后在瘤胃的最终浓度为0.05％）的韩国本地奶牛比对照组奶牛（灌注100ml蒸馏水）的瘤胃pH值低。除了在灌注后9h瘤胃pH值受到影响显著外，随着灌注后时间的推移，瘤胃pH值逐渐升高。这与Tamminga (1979)试验的结果一样，试验中pH值在（6.32±0.02）～（6.83±0.04）这一范围时，纤维和蛋白水解均达到最佳效果。在饲喂后6h，对照组和饲喂吐温80的试验组韩国本地奶牛瘤胃氨氮（NH3-N）的浓度分别为13.45和15.39 mg/dl。不管是否添加吐温80，韩国本地奶牛瘤胃内氨氮[（9.78±0.56 ）～（21.21±0.77）mg/dl]都比Satter和Styter（1974）所指出的足够用于微生物生长和微生物蛋白合成的浓度水平（5mg/dl）高。同时，氨氮浓度的升高预示着灌注非离子表面活性剂能使更多的植物性蛋白在瘤胃内降解。这与上面报道的添加NIS能提高瘤胃蛋白酶浓度的结果相一致。添加吐温80的试验组韩国本地奶牛相对于对照组，瘤胃内VFA在饲喂后3h升高20％。添加吐温80的韩国本地奶牛瘤胃内VFA浓度升高主要是由于增加了瘤胃内乙酸和丙酸浓度。饲喂吐温80的奶牛乙酸和丙酸浓度高，而对照组奶牛体内的乙酸和丙酸浓度较低。瘤胃内微生物细胞生长率在饲喂后3h与6h提高34％。
不过，Hristov(2000)报道，10头娟姗牛（70％压片大麦和30％苜蓿干草为基础）每千克日粮中添加2g吐温80和对照组相比，瘤胃pH值、氨氮、游离氨基酸总量、还原糖和VFA、VFA不同成分的相对量、液相粘性、瘤胃消化物和微生物蛋白流入量都没有影响（P> 0.05）。添加吐温80（0.02%, vol/wt,干物质基础）也不影响舍饲肉羊瘤胃pH值和氨浓度（McAllister等，2000），体外添加不同水平的吐温80（0.05%、0.10%和0.20％）研究发现，仅仅是氨浓度显著提高（P<0.05），pH值、总游离氨基酸、降解糖、可溶解蛋白、总VFA、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和乙酸：丙酸比例都不受影响（Hristov等，2003）。
6 消化率
Kamande（1994）证实了在绵羊干草饲料中添加0.5% 吐温80能提高整个消化道内干物质降解率9.1个百分点。之后，Kamande等（2000）试验表明，在添加吐温80的混合微生物培养物中，受微生物作用的纤维素降解率显著提高(P<0.05)。无表面活性剂或0.25%吐温80的混合微生物培养物孵育24h，纤维素降解率分别为（x±SD）（0.60±0.21）和（1.04 ±0.32）μg/ml·h。Hristov等(2000)试验显示，给肉牛饲喂由吐温80处理的（饲喂前快速地在日粮中添加2g/kg干物质的吐温80）大麦日粮的干物质降解率显著高于饲喂由70%大麦和30%苜蓿为基础组成日粮的干物质降解率（P<0.05)，但是总肠道大麦干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维降解率、大麦和苜蓿干草干物质有效降解率和血糖及尿素水平都没有显著差异（P>0.05)，只有大麦干物质消失速度比对照组有所提高。
Goto等（2003）报道添加表面活性剂吐温80相对于对照组，能显著提高幼嫩和成熟的鸭茅酶解率（幼嫩和成熟鸭茅的吐温80添加剂量分别高于0.005％和0.01％）。添加与不添加吐温80相比，幼嫩鸭茅叶片的酶解率的差别在孵育后6h比24h要大。孵育24h以上，吐温80对叶鞘和茎部的DM降解率影响较小。因此，添加吐温80提高鸭茅DM降解率与以前的滤纸酶解率结果非常吻合（Castanon和Wilke，1981）。
7 生产性能
给奶牛日粮添加0.2％或0.5％的吐温80能使每头奶牛每天的产奶量升高2.5～3.5kg（Shelford等，1996）。在舍饲肉羊的试验中，吐温80（0.02%,vol/wt）处理的草料日粮相对于未处理的会降低DMI和日增重（P<0.05），增加肉羊的育肥天数。然而，用表面活性剂处理日粮精料并不影响肉羊的育肥天数。不过，DMI、有机物摄入量、氮代谢、微生物氮、饲料转化率、胴体重、色泽、等级打分（腿、腰和肩）、肾脂肪含量等都不受日粮草料和精料是否添加吐温80的影响（McAllister, 2000）。Lee等（2003a）报道，相对于对照组，添加吐温80提高了干物质采食量和产奶量，不过奶牛在试验开始时的体况打分一致，而在产犊后的42d显著降低（对照组3.8；添加NIS的试验组2.9）。添加NIS降低了奶牛血液非酯化脂肪酸（NEFA）的浓度，这一值在妊娠末段迅速升高，在产犊后稍有降低。血液葡萄糖含量不受是否添加NIS的影响。
8 吐温80的作用机制
吐温80的作用机制至少可归结于两方面原因：①增加了酶释放量和（或）升高了酶的活性；②促进了酶和底物之间的相互作用。
8.1 增加酶的释放量和（或）提高酶活性
Reese和Macguire（1969）报道，吐温80能促进胞内酶的释放。人们早已知道吐温80能促进好氧真菌释放纤维素酶复合体（Deshpanda等，1987）。也有很多文献报道吐温80能提高酶的活性（Kim等，1982；Kamande等，2000；McAllister等，2000；Lee等，1998a、2003a、2003b、2004）。Kim等（1982）指出，向发酵体系添加吐温80能提高纤维素酶活性。McAllister（2000）同样发现，吐温80能促进纤维素酶在体外的活性。Hristov等（2003）报道，吐温80能显著提高淀粉酶活性（P<0.05）。Lee等（1998a、2003a、2003b、2004）研究发现，吐温80因能刺激混合的瘤胃厌氧微生物培养物释放酶和增加瘤胃微生物的数量（包括细菌、真菌和原虫）而提高了酶的活性。吐温80不仅能显著增强个体细胞降解酶和其它一些酶的活性，而且也能促进微生物细胞结合酶向瘤胃液及食糜的释放。添加吐温80提高了瘤胃胞外酶活性可能是由于增强了厌氧微生物细胞膜的渗透性（Eeese和Maguire，1969；Yazdi等，1990），或者降低了膜的屏障作用（Hungate，1966），厌氧真菌在这种情况下就会释放出更多的酶。
8.2 促进酶和底物之间的互作
瘤胃微生物通过产生的酶消化饲料。微生物产生的酶与它们底物的接触是发生酶解的前提。瘤胃内容物是由一些液体和固体组成。多糖水解酶分泌到瘤胃液，在与其底物接触之前有可能被蛋白酶水解或从瘤胃内冲走的弊端。很明显，吸附到饲料颗粒上是微生物延长其在瘤胃内的滞留时间和同其底物充分接触的最有效方式（Wang和McAllister，2002）。附着作用对于草料和谷物在瘤胃内降解是绝对必要的（McAllister等，1994、1996）。同时，纤维降解率与纤维酶同其底物的接触程度密切相关（Lee等，1982；Teeri，1997）。附着到底物上的酶通常比悬浮在瘤胃液内的酶活性更高（Pell和Scolfield，1993）；包括NIS在内因为其界面活性作用而提高了酶与底物之间的吸附性，因而预料其能够提高瘤胃内酶的效率。因此说微生物吸附到纤维素和其它纤维性日粮成分对反刍动物优化饲料利用非常重要。尽管分解纤维素的个别微生物表现出不一致的吸附机制和纤维素酶组成，影响其附着底物的因素可能也影响其对纤维素的消化（Kudo等，1987）。不过，纤维素酶附着底物的程度通常和纤维素水解率呈平行关系（Beltrame，1982；Lee，1982）。
Goto等（2003）试验发现，表面喷洒表面活性剂的鸭茅有较高的酶活可能与饲草细胞结构的物化松弛有关。这一事实可能进一步促进纤维素酶与鸭茅细胞壁的易接触或不易接触位点迅速而紧密地接触。表面活性剂也能延长酶活时间，可能是由于在其失活之前促进了其溶解性（Steve等，1993）。因此，在一些研究中，NIS提高酶解速度和程度是由于促进了酶与纤维素和半纤维素等细胞成分的互作。
9 安全性
吐温80 的半致死剂量（LD50）为25g/kg（bw）。吐温80在食品加工中被广泛作为添加剂使用（Griffin和Lynch，1972），添加在动物饲料中通常被认为是安全的（Kamande等，2000）。
10 结论
瘤胃作为一个巨大的“黑箱”吸引了众多的目光。操控瘤胃发酵提高动物生产性能是一个持续的过程。非离子表面活性剂已经作为有效地添加剂刺激需氧微生物的生长。文中报道了吐温80刺激厌氧瘤胃微生物的生长、提高酶活力和改善瘤胃生态，从而提高了干物质消化率和奶牛产奶量。尽管一些NIS对瘤胃微生物和瘤胃发酵特征有负作用，还是表明吐温80可能成为一种新型饲料添加剂能够安全且简便地应用于反刍动物来调控粗饲料条件下的瘤胃发酵而提高饲料营养价值和反刍动物生产性能。对吐温80的添加效果仍存在一些有争议的地方还需进一步研究验证。
参考文献（略）
