国外鱼用益生素的研究进展

蔡俊鹏1，吴冰2

(1．华南理工大学食品与生物工程学院，广东广州 51061；
2.南理工大学分析测试中心 广东广州510641)

摘 要：近十年来，国外在鱼用益生素方面开展了一定的研究，取得了一些进展。在介绍益生菌这一概念及其作用机理的基础上，阐述了作为益生菌所必备的基本条件，综合介绍了益生素在鱼虾贝类等的应用研究结果，指出了今后在该方面研究时应当注意的3个关键问题。

关键词：鱼；虾；贝类；益生素


ABSTRACT： In the decade,certain investingations on the probiltics application in aquaculture have been carried out in foreign countries and some progress has been made.On the basis of reviewing the concept of probiotics and their protectional mechanisms, the essential criteria for the selecting probiotic candidates were illustrated,the recent progrees made on the probiotic appli-cations in culturing fish,shrimp and shellfish introduced,3 Key considerations for the future research .
KEYWORDS: fish;shrimp;probiotics
在人口不断膨胀的压力下，世界许多国家都在利用一切可以利用的自然资源，以解决人类温饱的问题。利用水体资源，发展鱼类养殖业，也就是其中的办法之一。之前，世界许多国家的鱼类养殖发展相当快，但随之而来的鱼病问题也日益突出。对付它的手段，目前主要是依靠抗生素，或者作为饵料的添加剂或者直接作为鱼药而达到控制鱼病的目的。但是，由于抗生素的长期使用或滥用，病菌的抗药性也越来越明显，导致用药量越来越大，使用效果越来越差，甚至无效。虽然在一些国家，对某些特定的鱼病，已开发出鱼用疫苗且取得良好的效果，但由于在幼苗时期，鱼虾等并不具备特异免疫应答能力，因此对此一阶段鱼病的防治仍没有良好的对策。在这种情况下，寻找其它有效的控制手段，也就是科学家的主要研究课题。以有益生物控制病害的思想在国外也就日益受到重视，有关鱼用益生素的研究报道也与日俱增。
1 益生素(probiotic)的定义
益生素，又称益生菌、利生菌、活菌制剂、或微生物制剂。按照1987年提出的概念，益生菌是“一种经过培养的、活的微生物饵料添加剂。它通过改善宿生肠道菌群的平衡，从而使得宿主获益”。在此，益生菌的定义强调了活的微生物和饵料添加剂两个方面。1999年，把益生素的概念定义为“任何使得宿主获益的微生物制剂(不一定是活的)或细胞组分”。在这里，和饵料的联系没有了。与此同时，Gram等则提出益生素应该是“任何活的微生物制剂，通过改善宿主的微生态平衡而使得它获益”。当前，之所以对益生素的概念有不同的提法，主要是因为在一些国家，对益生素和免疫疫苗的使用有不同的法规，当然也就影响到它的安全性评价问题。在水产养殖界，实际上有些有益细菌既被用作饵料添加，又被用作控制和改善养殖水体微生物菌群的生物菌群的生物制剂。对此，Gatesoupe认为严格的益生素概念应该是指这样的一群微生物，它们进入到宿主的消化道，并活在那里，以求得改善宿主的健康。对于在养殖水体中增加某类活体微生物，以分化、降解水中污染物或有机废物，进而达到改善养殖水质的目的的，Gatesoupe认为是属于生物修复(Bioremediation)的范畴。鉴于此，本文将主要介绍用作饵料添加剂的益生素研究进展。
2 益生素的作用机理
目前，科学家对益生素的作用机理仍不十分了解，但基本上是通过调控宿主体内微生物群落的平衡，但基本上是通过调控宿主体内微生物群落的平衡，增殖有益细菌，抑制有害细菌,从而使前者成为优势菌群，由此使宿主获益。归纳起来，益生素的作用机理可能有如下3点：

(1)通过分泌抑制性物质、竞争营养物质、竞争宿主的着附点或通过竞争排斥的原理,抑制有害细菌的生长繁殖；
(2)通过增加或减少胞外酶的分泌，改变其它微生物的代谢活动；

(3)通过提高抗体水平或巨噬细胞的活动，从而提升宿主的免疫能力。
3 作为益生素的菌株所必具的条件
筛选用作益生素的菌株, 主要应从以下三个方面展开工作：(1)进行体外实验，判断后选菌是否表现出对致病菌的拮抗作用；(2)研究后选菌在相关宿主消化道根殖的可能性(colonization);(3)完成人工感染试验，以断定后选菌确能提高宿主的抵抗力。Austin等则强调了作为益生素的菌株，必须具备以下3个基本条件，即：(1)必须对宿主无害；(2)被宿主摄入后，必须有证据表明它能增进宿主的食欲；(3)在人工感染的试验中，必须观察到后选菌有拮抗保护作用。到目前为止，国外所发表的有关鱼用益生素的研究大多数都是从后选菌是否表现出对致病菌的拮抗作用的角度进行，从多个方面同时对后选菌进行考察的，仅见少数几篇报道。
4 益生素在水产养殖业的应用
益生素在水产养殖业的应用研究，最早见于1986年的报道。进入20世纪90年代，由于它具有诱人的应用前景，有关研究报道与日俱增。下面按它在不同养殖种类上的应用简要地作一介绍。
4.1 在鱼类养殖中的应用
4.1.1 在幼苗阶段的应用

1991年，报道了益生菌Lactobacillus plantarum和L.helveticus能促进大鲮鲆
(Scophthalmus max-imus)幼苗生长的研究。1998年，报道了一项研究成果。在实验中，他们给大西洋鳕鱼鱼苗投放分离自鳕鱼畅道的Carnobacterium divergens和/或免疫激发的多肽，3周后再接受病菌Vibrio anguillarum(107/ml,1h)的攻击。虽然4周后的累积死亡率在各个试验组中基本持平(80%～84%)，但是在感染后12d内，分别饲喂活菌和多肽的试验组，鱼苗的累积死亡率要比对照组的低。对此，作者的解释是，虽然在感染开始时，C.divergens和多肽有一定的保护作用，但由于致病菌数量很大，慢慢地，它们也就失去了保护作用，最终导致更多鱼的死亡。此外，C.eivergens能在多种鱼的肠道中根殖，这为研发广谱性的益生素提供了依据。2000年，又报道了一项实验结果。为此，他们把鱼卵和幼苗分别浸泡在含有非致病菌V.salonicida或L.plantarum或致病菌V.iliopiscarius sp.nov的水中，而对照组则按正常的方式进行，经过一定时间后再检查它们的存活比。结果表明，和对照组相比(存活率为58.2%)，非致病菌V.salmonicida或L.plantarum浸泡的鱼苗在孵化后第32天的存活率分别为72.8%和68.4%，而经V.iliopiscarius sp.nov.浸泡的鱼苗，其存活率仅为41.8%。由此揭示了通过微生物学手段以提高幼苗成活率的可能。
4.1.2 在成鱼阶段的应用
1995年，通过实验，发现有一株V.algi-nolyticus菌株对鱼的致病菌V.ordaill,V.anguil-larum,Aeromonas salmonicida,Yersinia Yersinia ruckeri 表现出拮抗作用，在进一步的人工感染试验中，他们观察到该菌核对大西洋三文鱼(Atlantic salmon)的益生保护作用，使鱼对A.salmoncida,V.anguillarum,V.ordalii的敏感性降低。1997年，Joborn等从大西洋三文鱼消化道中分离筛选出一株C.inhibens K1菌株。体外实验表明，该菌株能产生抑制鱼病原菌的物质。在活体实验中，他们发现，该菌株在鱼的肠道及排泄物中仍处于活跃的代谢状态。该菌株的益生保护作用在2000年的研究中得到进一步的证实，并报道了C.inbibens K1菌株作为大西洋三文鱼和虹鳟鱼的益生菌的研究结果。体外实验表明，该菌株对下列病原菌有拮抗作用：
A.hydrophila,A.salmonicida,Flavobacterium psy-chrophilum,photobacterium damselae subsp.piscicida,Streptococcus milleri,V.anguillarum和V.ordalii。在进一步的饲喂试验中，发现用该益生菌喂养14d后的鱼，对A.salmonicida，V.ordalii和Y.ruckeri的抵抗力增强，存活率增大。从鲆鱼(Paralichthys oli-vaceus)分离并筛选出一菌株，Lactobacillus sp.DS-12。它表现出强的抗菌活性，能抑制鱼病原菌如Edwardsiella tarda,Pasteurella piscida,A.hydrophila和V.anguillarium的生长。在2次各为期1个月的饲喂实验中，他们发现，饲喂含有DS-12菌株的试验组，鱼平均体重的增加均要比对照组的快。本研究揭示了益生菌可能同时拥有的既促生长又能抑菌的双重机能。1999年研究了菌株的可能。体外以及活体实验研究表明，该菌株对鱼致病菌V.an-guillarum表现出抑制作用。进一步的人工感染试验证实，与对照组相比，受到菌株P.fluorescens AH2保护的试验组，虹鳟鱼的累积死亡减少了46%。
4.2 在虾类养殖中的应用

1998年，对如何利用有益生物控制养虾池的病害进行了研究。通过在试验池投入浓度在1×104到1×105个/ml之间的Bacillus spp.细菌，研究者发现，养在该池的虾在160d里一点问题都没有，相反，对照池的虾养不到80d，己因萤光Vibrio病而死得差不多，由此展示了利用有益微生物控制虾病发生的可能性。2000年研究了Bacillus S11菌株的黑虎虾(Peneaus monodon)的益生保护作用。通过90d的试验发现，饲喂含有Bacillus S11菌株的黑虎虾，生长得好，抗病能力强，即使受到107/ml致病菌V.harveyi的人工感染，其存活率(54.3%)也比对照组(35.5%)高，由此证明了该益生菌的促生长和抗病保护作用。在进一步的免疫学研究中，他们发现，Bacillus S11菌株的抗病保护作用是以下两种途径而获得：一方面通过激活细胞和体液免疫系统，从而提高鱼的免疫力；另一方面通过在虾的消化道中竞争排斥作用，减少肠道中的有害菌群，也就减少了有害菌的致病机会。在较早的一项研究中，甚至获得更好的结果：试验组的黑虎虾在人工感染后100%存活，而对照组的存活率仅有26%。此外，有报道在厄瓜尔多，有的虾苗场和孵化场采用一些Vibrio的非致病菌株，包括V.Alginolyticus,V.hollisae,V.fluvialis,V.piscium，以达到控制虾病的目的。
4.3 在贝类养殖中的应用
1994年报道了一项研究成果：可能归属于Alteromonas的菌株CA2表现出促进太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)生长、提高其成活率的功能。2000年从养殖孵化场分离到一组能抑制V.esplendidus,V.alginolticus,和A.hydrophila生长的菌株(菌株11，77和C33)，并对智利扇贝(Argopecten purpuratus)幼体能否吸入菌株以及相关菌株能否根殖于扇贝消化道进行了探讨。研究结果表明，在含有106个/ml细菌的水中浸泡6h，扇贝幼体吸入菌株11和77的细菌，但不吸入C33菌株。另外，菌株77能够占据扇贝消化道，成为优势菌。研究结果还揭示，菌株77有望成为智利扇贝养殖的益生菌。Gibson等(1998)探讨了A.media A199菌株对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的益生保护作用。他们发现，当太平洋牡蛎2～6d的幼苗单独受到致病菌V.tubiashii感染时，5d内即死亡；相反，在有A.media A199菌株存在时，致病菌V.media A199的人工感染没有导致幼苗的死亡。A.media A199菌株除了对V.tubiashii有拮抗作用外，还对许多其它鱼和贝类的病原体也有相同的作用，展示了该菌株作为广谱益生菌，在牡蛎养殖业的潜力。另外，研究发现，当菌株Roseobacter(BS107)和V.anguillarun一起培养时，前者明显表现出对后者的抑制作用。在更深入的探讨中，他们观察到菌株BS2107的细胞提取物对扇贝幼体的存活率有正面的影响。
4.4 在鱼用饵料中的应用
对于卤虫Artemia spp.来说，V.proteolyticus是它的死亡天敌。研究揭示，该致病菌首先侵袭卤虫的微绒毛和消化道的上皮细胞，破坏细胞间的连接，进入机体内部，再进一步地破坏机体组织，最终导致卤虫的死亡。为了能采用生物的手段控制卤虫病害，Verschuere等(1999)首先从健康的卤虫体上分离出细菌菌株，经过活体括抗实验，发现有9株菌株能对V.proteolyticus产生拮抗作用。在进一步的试验中，不但证实了该9株菌株对卤虫的保护作用，而且也阐明了它们是通过竞争排斥的机制而起作用的。通过生化试验，初步鉴定该9株菌株归属于Aeromonas和Vibrio两属，种类可能是A.hydrophila，或A.caviae,V.alginolyticus。在对轮虫(Brachionus plicatilis,B.rotundiformis)的研究中发现，在培养过程中添加Alteromonas菌株或一株革兰氏阴性菌(B3)能够提高轮虫的生长速率。采用以Bacillus spp.为主的混合益生素对轮虫(B.plicatilis)生长的影响展开研究，结果同样表明益生素能促进轮虫的生长。此外，以L.lactis AR21为益生素，对轮虫的生长及其拮抗病原菌V.anguillarum也进行了探讨。研究结果揭示，该益生菌对轮虫的生长有促进作用，对病原菌V.anguillarum则表现出拮抗作用。
5 结论与展望
从目前的研究报道看，益生菌在水产养殖中的应用前景是诱人的。它通过分泌抑制性物质、竞争营养物质、竞争宿主的着附点或通过竞争排斥的原理，抑制有害细菌的生长繁殖，达到控制鱼病的目的。此外，有的益生菌还具有促进鱼类食欲、生长和或增重的作用。因此，在水产养殖业，单一或混合益生菌完全有可能取代目前所用的抗生素、化学促生素，成为21世纪人们所接受的绿色微生物制剂。但要真正把益生菌这种潜能变成现实，尚有一段距离，仍需要大量的研究投入。首先要回答的、同时也是最重要的问题，就是它是否对鱼虾贝类有害，包括直接的和间接的，假如益生菌其本身是无害的，那它是否有可能通过摄取有害病菌的致病基因，而转变成有害菌，进而更严重地危害渔业? 鉴于自然界中许多细菌都具有天然的转化能力，因此，这种可能性是存在的，不容忽视。在用一些与致病菌亲缘关系相当紧密的菌株作为益生菌的场合，这种可能性更不容忽视。其次，它是否具有广谱促生保护作用? 有的益生菌只能在单种宿主的消化道根殖，有的则能根殖多种宿主；有的只能分泌专门针对某一病菌的抑制物，有的则能产生广谱性的拮抗物质。研究清楚益生菌的适用对象和范围，可以为科学地、有针对性地应用某一益生菌奠定基础。最后，在制备益生素时，以何种方式效果最佳? 是以干粉的形式? 还是以液体的形式? 抑或其它形式? 不同的制剂方式可能会影响到益生菌的存活率、代谢活力，尤其是分泌抑制性物质的能力。代谢不旺的益生菌自然不可能在宿主体内与致病菌竞争营养物质和/或着附点，更谈不上分泌物质以抑制对方了。如果在筛选益生菌时能考虑以上3个问题，我相信，鱼用益生菌的前景是相当可观的。