对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用
日期：2006-4-13 10:50:00 来源：河南畜牧网 主题：对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用
作者:谭北平
★ 国家高技术研究发展计划（863计划）课题成果（2001AA622
060和2003AA622060）
我国饲料工业起步于20世纪70年代，至2004年，我国饲料年产量已超过8 500万吨。但随着我国养殖业集约化程度的提高和饲料工业的发展，抗生素、化学合成药和类固醇激素，如促长素、驱虫剂、激素、调味剂、改良剂、色素剂、防腐剂等饲料添加剂也随之普遍使用。
抗生素作为饲料添加剂使用已有50年的历史，为动物的生长和健康作出了巨大贡献，是目前饲料中用量最大、最广的添加剂之一。自1975年日本最早报道病原菌抗药性现象以来，人们发现，由于大量和滥用抗生素已给动物本身、动物产品和环境带来一系列的问题。主要表现在，动物病原菌产生抗药性，导致抗生素用量的增加，引起内源性感染和二重感染。特别是长期使用会造成消化道内本身微生态失调和环境的污染。同时抗生素在产品中的残留还直接影响人类的免疫和健康。水产品食用安全问题越来越受到人们的普遍关注。
欧盟对于中国出口动物产品的药物残留及安全生产体系提出了更高、更具体的要求，直接影响了我国动物产品对欧盟市场的出口。俄罗斯、日本等也纷纷限制我国动物产品的出口，使得我国近年来动物产品的出口急骤下降。香港发生的禽流感以及某些大陆供港猪中检出β-兴奋剂（β-agonist）等也极大地影响了大陆畜禽的供港配额，使我国政治形象和经济利益受到严重损失。
我国是水产养殖大国，然而水产品出口创汇率却与我们的产量远不相符。加入WTO以后，我们将拿什么样的产品来参与国际竞争？我们如何应对欧盟、美国、日本等国际市场越来越严格的技术壁垒？很显然，水产养殖中过分依赖抗菌素的局面必须从根本上改变，绿色环保型添加剂的研究与应用应受到重视。
如何对待因使用抗生素产生的负面效应，WHO认为最有效的战略是对人和食用动物合理使用和尽可能少使用抗菌素。免疫增强剂是无害、无污染的绿色环保产品，在水产养殖中的应用前景是诱人的。从食品的安全性、人类的健康和环境保护的角度来讲，免疫增强剂作为水产饲料添加剂符合可持续发展的要求，是饲料业发展的必然方向。本课题的总体目标是研究开发先进、稳定的对虾和贝类非特异性免疫增强剂，研究产品的应用技术，并实现产业化生产。
1 课题取得的主要成果
对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用是国家高技术研究发展计划（863计划）海洋生物技术主题在“十五”期间设立的唯一一项关于水产饲料添加剂的课题。该课题研究了免疫增强剂作为饲料添加剂在对虾、鲍鱼全周期养殖期间以及作为药物浸浴剂在对虾、扇贝、鲍鱼育苗期的应用技术，重点解决了最佳使用时机、持续时间以及使用剂量等。
1．1 建立了完善的免疫指标体系
通过对来自未发病虾池、发病虾池和曾发病虾池大量对虾样品的多项免疫指标及感染白斑综合症病毒状况的综合分析和测定，进行了白斑综合症病毒(WSSV)感染与对虾的相关免疫因子的相关性研究（见图1）。研究结果证实：WSSV感染与对虾血淋巴酚氧化酶活性和碱性磷酸酶相对活性密切相关，如果对虾机体的酚氧化酶和碱性磷酸酶活性处于较高水平时，对虾即使已感染了病毒也不会发病，但对虾机体的酚氧化酶和碱性磷酸酶活性处于较低水平时，潜伏感染的对虾可引发病毒的迅速增殖，乃至发病；发病虾的各项免疫指标其平均值低于未发病虾；对虾感染病毒可引发机体过氧化物酶活性显著降低。此外，酸性磷酸酶活性、血淋巴吞噬活性、血细胞密度等指标也与对虾病毒感染关系密切。
因此，以对虾病毒感染与机体免疫的相关关系为基础，在国际上首次正式确认对虾病毒感染与机体免疫密切相关的免疫指标（5个）——酚氧化酶活性、碱性磷酸酶活性、酸性磷酸酶活性、血细胞密度、淋巴细胞吞噬活性，作为多糖类免疫增强剂筛选的敏感指标，这为筛选出高效稳定的免疫增强剂奠定了理论基础。
1.2 进一步优化了β-1，3-D-葡聚糖制剂的生产工艺，使制剂中活性成分的含量由过去的18%提高到25%。生产能力达到月产10t。
1.2.1 生产工艺
在前期的研究工作基础上，通过改进细胞壁酶解技术、滤渣后处理技术，制剂中活性成分含量已由过去的18%提高到25%；生产能力也明显提高，月生产能力达到10t。
主要工艺技术参数：高压加工压力40MPa，控制反应pH6.5，反应温度55℃，时间8h，后处理酸度调整为pH4.0，喷雾干燥前浓度35%，进风与出风温度分别在195℃和85℃。β-1，3-D-葡聚糖制剂产业化的工艺流程见图2。
1.2.2 产品的主要技术指标
1.2.2.1 产品中主要活性成分的含量 经中国科学院广州化学研究所分析室的检测，产品中β-1，3/1，6-葡聚糖含量大于25%。
1.2.2.2 产品的主要技术指标和水平 产品中活性成分含量不低于25%，水分小于7%，粗脂肪不高于0.5%。产品保质期在12个月以上。产品细度：200目筛上物不高于5%。产品为淡黄色或接近白色粉末；无异常气味和滋味；流动性好、不吸潮、不结块。铅、砷、汞、镉等重金属的含量符合食品级要求。
1.2.3 产品的应用效果
1.2.3.1 室内饲养试验
研究了从啤酒酵母泥悬液中提取的β-1，3/1，6-葡聚糖制剂（含25%β-1，3/1，6-葡聚糖）对南美白对虾生长及免疫力（酚氧化酶活性、血细胞吞噬活性以及超氧阴离子[O2-]产量等）的影响。基础饲料（表1）中分别添加3个水平（0.1%，0.2%和0.4%）的β-葡聚糖制剂配制成3种试验饲料，以基础饲料作为对照组。试验饲料采取间隔投喂的策略，即每投喂15d试验饲料后再投喂15d对照饲料，整个饲养试验持续60d。
饲料中添加β-1，3/1，6-葡聚糖制剂显著促进南美白对虾生长、降低饲料系数（表2）。增重率随着饲料中β-1，3/1，6-葡聚糖制剂添加量的升高而上升，当添加量≥0.2%时，试验组的增重率显著高于对照组（P<0.05），但添加量为0.2%和0.4%的试验组之间差异不显著；相应地，饲料系数随着饲料中β-1，3/1，6-葡聚糖制剂添加量的升高而降低，添加β-1，3/1，6-葡聚糖制剂的试验组的饲料系数显著低于（P＜0.05）对照组，但3个试验组之间差异不显著。60d的饲养试验期间，成活率都很高（94.67%～100%），各处理间差异不显著。
饲料中添加β-1,3/1,6-葡聚糖制剂对南美白对虾免疫力产生显著影响（表3）。当饲料中添加β-1，3/1，6-葡聚糖制剂≥0.1%时，血细胞总量、吞噬百分数、吞噬指数以及酚氧化酶活性等指标均显著高于（P<0.05）对照组，但随着β-葡聚糖制剂添加量的进一步上升，上述免疫指标始终维持在一个相对恒定的水平（P>0.05）。平均每个血细胞吞噬的异物数（ABPC）在对照组与试验组之间均无显著差异（P>0.05）。
饲料中添加β－１，３/１，６－葡聚糖制剂显著提高对虾血细胞活性氧的产量。添加β－１，３/１，６－葡聚糖制剂的试验组，相对活性氧产量（ＲＡＰ）是对照组的１．８９～２．１２倍，但β－１，３/１，６－葡聚糖制剂的添加量（≥０．１％）对活性氧产量无显著影响（图３）。
观察了攻毒后14d内对照组和试验组对虾的死亡情况并统计了累计死亡率（图4）。对照组的累计死亡率显著高于添加β-葡聚糖制剂的3个试验组，至攻毒后第7d，对照组的累计死亡率为33.3%,而试验组的仅为5.0%～6.6%；至第14d，对照组的累计死亡率为80%,而试验组的仅为16.6%～20.0%（图4、表4）。在攻毒后的14d内，3个试验组的对虾死亡情况和累计死亡率很接近，彼此之间无显著差异。
计算了试验组的免疫保护力（表4）。至攻毒后第7d，试验组的免疫保护力为80.25%～84.85%，3个试验组之间无显著差异；至第14d，试验组的免疫保护力为75.0%～80.0%，3个试验组之间仍无显著差异。
1.2.3.2 大田推广应用效果
湛江、海南等地的高位虾池全周期养殖试验结果显示，南美白对虾成活率比对照组提高20%以上，饲料系数降低15%～20%。
1.2.3.3 β-葡聚糖制剂在中国对虾育苗中的应用
分别用5种不同浓度（0, 0.1，0.3，0.5，1mg/ml）的β-葡聚糖溶液对中国对虾蚤状、糠虾幼体进行3h浸浴，48h后用浓度为5.9×106cfu/ml的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）进行攻毒。攻毒后再养殖48h。结果显示，0.1、0.3和0.5mg/ml处理组均显著提高（P<0.05）蚤状和糠虾幼体攻毒后的存活率，其中，0.3mg/ml和0.5mg/ml的处理组还显著提高（P<0.05）蚤状幼体的变态率和生长，但对糠虾幼体生长的影响不显著（P>0.05）。本研究结果表明，β-葡聚糖可以作为免疫增强剂在中国对虾育苗阶段使用，建议浸浴使用的浓度为0.3～
1.2.3.3 β-葡聚糖制剂在中国对虾育苗中的应用
分别用5种不同浓度（0, 0.1，0.3，0.5，1mg/ml）的β-葡聚糖溶液对中国对虾蚤状、糠虾幼体进行3h浸浴，48h后用浓度为5.9×106cfu/ml的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）进行攻毒。攻毒后再养殖48h。结果显示，0.1、0.3和0.5mg/ml处理组均显著提高（P<0.05）蚤状和糠虾幼体攻毒后的存活率，其中，0.3mg/ml和0.5mg/ml的处理组还显著提高（P<0.05）蚤状幼体的变态率和生长，但对糠虾幼体生长的影响不显著（P>0.05）。本研究结果表明，β-葡聚糖可以作为免疫增强剂在中国对虾育苗阶段使用，建议浸浴使用的浓度为0.3～0.5mg/ml。
1.3 进一步改进了A3a肽聚糖制剂的中试工艺
在以前的研究工作基础上，采用PVC材料的自制发酵罐，简化了发酵步骤，提高了发酵产量。采纳了酸沉降和离心相结合的菌体收集方式，产能明显提高。
1.4 对虾专用复合微生态制剂的研制与应用
1.4.1 微生态制剂功能菌株的分离、筛选和鉴定
对虾微生态制剂功能菌株的分离、筛选和鉴定技术：在对虾病毒感染相关免疫的基础上，考察正常和病毒感染耐过对虾的微生态菌群，从对虾肠道或养殖水体中分离微生态菌株。菌株的分离采用常规的细菌分离技术，有益微生态菌株的筛选采用与过病原微生物的培养抑制试验、对虾口服和各种浓度浸浴等对照进行，菌株的鉴定通过快速鉴定试剂盒结合生化及分子生物学鉴定技术进行。
1.4.2 产业化工艺流程及关键技术（图5）
1.4.2.1 功能菌株的筛选
目前市场上的微生态菌株大多都是从陆生环境或畜禽动物体内分离出来的，因此由这些菌株生产出来的微生态制剂对水产动物的作用是有限的。利用科学的方法和创新的思路，分离筛选出对虾或贝类专用微生态菌株将具有十分重要的意义。在对虾病毒感染相关免疫的基础上，考察正常和病毒感染耐过对虾的微生态菌群，在此基础上筛选微生态制剂用于防御对虾病毒感染具有重要创新。
1.4.2.2 特殊的包被、干燥工艺
微生态制剂发挥作用的一个前提条件就是产品中的活菌要能在试验动物肠道内存活并增殖。由于对虾、贝类（比如鲍鱼）饲料特殊的制粒工艺（高温、高压、高湿），就需要筛选出耐受性强的菌株，同时还要采取特殊包被、干燥工艺。
通过探索微生态制剂特殊包被工艺来提高饲料中的活菌数目。通常，微生态制剂在饲料加工制粒时的高温高压下大量失活，难以发挥其作用效果，利用特殊的包被工艺来“包裹”菌株，从而提高微生态菌抗高温、高压、高湿的能力。同时，采用超低温冷冻工艺对乳酸菌和节杆菌等进行干燥。
1.4.3 产品的企业标准
产品由芽孢杆菌、乳酸菌、节杆菌等8株菌组成，菌含量不小于109CFU/g；水分不高于7%，粗脂肪不高于0.5%。在常温下保存6个月以上不失效。产品细度：200目筛上物不高于5%。产品为淡黄色或接近白色粉末；无异常气味和滋味；流动性好、不吸潮、不结块。铅、砷、汞、镉等重金属的含量符合食品级要求。
1.4．4 产品的应用效果
1.4.4.1 室内试验
做了18株益生菌对弧菌的拮抗试验，从中筛选出弧菌拮抗菌。选用4株指示弧菌，分别是1594（漂浮弧菌）、1623（沙蚕弧菌）、1614（副溶血弧菌）、E3-11（鳗弧菌）。结果表明，在有拮抗作用的18株菌中，有8株作用明显：菌株E5对1614、1623和E3-11均有明显拮抗作用，对1594有较弱拮抗作用；菌株N6对E3-11和1623均有明显拮抗作用，对1594和1614有较弱拮抗作用；菌株N3对E3-11有明显拮抗作用；菌株En对E3-11、1614和1623均有明显拮抗作用，对1594有较弱拮抗作用；菌株Nn对1623有明显拮抗作用，对1594有较弱拮抗作用；XWE-2和J-B对4种菌株均有明显的拮抗作用。
研究了饲料中添加对虾专用微生态制剂对南美白对虾主要免疫指标的影响。饲料中对虾专用微生态制剂的添加量设3个梯度：0.1%, 0.2%和0.4%。饲养时间为60d。结果表明，饲料中添加对虾专用微生态制剂可使对虾酚氧化酶活性、碱性磷酸酶活性、酸性磷酸酶活性、血细胞总数等主要免疫指标提高1～3倍。3个梯度之间无显著差异，表明在本试验条件下，饲料中对虾专用微生态制剂的添加量为0.1%。
1.4.4.2 大田应用
海南150亩高位精养虾池试验结果：对虾成活率提高21.4%，饲料系数0.98，比对照组降低19.2%。广东珠海100亩普通虾池选点试验结果表明，对虾成活率提高23.1%，饲料系数1.02，比对照组降低20.7%。
此外，在福建龙海等地的试验也得到了类似的结果，成活率提高，饲料系数下降。
1.5 复合免疫增强剂的研制与应用
1.5.1 产品的研制
从27个精心设计的复合免疫增强剂配方中筛选出了效果明显且稳定的对虾专用复合免疫增强剂配方2个、鲍鱼专用复合免疫增强剂配方1个，相关产品的配方生产工艺已申请国家发明专利，并已实现产业化生产。
1.5.2 应用研究
1.5.2.1 室内试验
研究了对虾用复合免疫增强剂（产品代号：DX-M1,专利申请号：03112114.4）和对虾用复方中草药免疫增强剂（产品代号：DX-M2,专利申请号：03112113.6）对南美白对虾生长、存活以及免疫力和抗病力的影响。
基础饲料中分别添加2个水平（0.1%和0.2%）的DX-M1或DX-M2，配制成4种试验饲料，以基础饲料作为对照组。试验饲料采取连续投喂的策略，整个饲养试验持续60d。
饲料中添加DX-M1或DX-M2显著促进南美白对虾生长、降低饲料系数。60d的饲养试验期间，成活率都很高（91.87%～100%），各处理间差异不显著。
饲料中添加DX-M1或DX-M2对南美白对虾免疫力产生显著影响。当饲料中添加DX-M1或DX-M2≥0.1%时，吞噬百分数、吞噬指数以及酚氧化酶活性等指标均显著高于（P<0.05）对照组，但随着添加量的进一步上升，上述免疫指标始终维持在一个相对恒定的水平（P>0.05）。但血细胞总量、平均每个血细胞吞噬的异物数（ABPC）在对照组与试验组之间均无显著差异（P>0.05）。
观察了白斑病毒匀浆液注射攻毒后7d内对照组和试验组对虾的死亡情况并统计了累计死亡率（见图6）。对照组的累计死亡率显著高于添加复合免疫增强剂DX-M1或DX-M2的试验组，至攻毒后第6d，对照组全部死亡，而试验组的仅为33%～40%。在攻毒后的7d内，各试验组的对虾死亡情况和累计死亡率很接近，彼此之间无显著差异。
计算了试验组的免疫保护力。至攻毒后第7d，试验组的免疫保护力为55%～67%，各试验组之间无显著差异。
1.5.2.2 大田应用效果
①广西120亩普通池选点试验结果表明，单造平均亩产1 010kg；对虾成活率提高29.1%，饲料系数1.02，比对照组降低21%。广东湛江100亩高位虾池选点试验结果表明，单造平均亩产1 780kg；对虾成活率提高19.2%，饲料系数1.0，比对照组降低20%。
②复合免疫增强剂用于稚鲍的养殖。鲍苗起始大小为0.8～1.0cm，经过60d的养殖，发现添加复合免疫增强剂的饲料有显著促进生长、提高成活率的效果。添加组平均壳长比对照组提高26.6%,日增重提高21.8%；成活率比对照组提高22%。鲍鱼大小整齐。
此外，在广东湛江等地的试验也得到类似的效果。
2 经济效益、社会效益分析
课题实施的3年时间里，推广销售各类免疫增强剂共计1 000余吨，创造直接经济效益4 000多万元；考虑到应用于对虾、贝类养殖从而提高养殖动物产量、提升产品品质，则间接经济效益超过40 000万元。
推广应用免疫增强剂产品，有利于减少或杜绝抗生素的使用，促进健康养殖，维持水产养殖业可持续发展；同时，生产绿色产品，有利于应对国际市场的“绿色壁垒”，增加出口创汇，克服渔农增产不增收的尴尬现象。
3 今后的研究方向
现在，基因技术已经渗入益生菌产品的生产中，使单个菌株的作用向多元化方向发展，培育出高耐受力、高活性、具有多重作用的基因工程菌。比如将芽孢杆菌中的芽孢移植到无芽孢的乳酸菌菌属上，使之变成耐高温的菌种；通过基因工程手段获得一些非肠道正常菌群的工程益生菌，使其能在肠道中“永久”定居，使其能更好地发挥益生作用；运用基因工程技术研究功能微生态制剂，通过对一些优良菌种的遗传改造，导入有用基因如必需氨基酸合成酶基因、疫苗抗原决定簇基因和生长激素基因等，让工程菌在肠道内就能产生某种必需氨基酸或某种病原菌的免疫保护蛋白刺激机体产生抗体或生长激素等，从而减少氨基酸、抗生素或促长剂的使用。
随着分子生物学技术的迅速发展和先进生产工艺与微囊技术的应用，可以利用基因工程技术培育我们所需特性的新菌株，同时可大幅度地提高微生物制剂的稳定性，必将为水产饲料微生物添加剂的应用提供广阔的前景，水产饲料微生物添加剂将作为抗生素、化学促生素的替代物而成为饲料工业中最有前途的添加剂之一。
饲料工业
