固态发酵生产木质素酶研究进展

作者:芦国营 张朝晖　洪伟杰

★ 浙江省教育厅重点项目（20040559）
浙江省自然科学基金（Y404107
木质素酶解是一种非专一性的、以自由基为基础的链反应过程[1]。木质素酶不仅对木质素，而且对许多种类的有机物尤其是人工合成的有机污染物都有很强的降解能力，而且具有高谱、高效、低耗、高适用性等特点。这种特殊的降解机制在饲料工业、化学工业、煤炭化学和环境保护方面展现了巨大的应用前景，已经引起了学术界和工业界的广泛关注。而目前木质素酶的生产大多采用合成培养基，进行液态深层发酵生产，必须添加昂贵的诱导物藜芦醇，并且发酵周期长，生产成本高，酶活低，难于进行大规模的生产。最近的几十年，学者逐渐开始用固态发酵技术生产木质素酶。它可模仿天然微生物的生长过程，生产人们需要的产品。本文综述了木质素酶固态发酵生产的最新研究进展。

1 固态发酵生产木质素酶的特点
产木质素酶的微生物一般都是丝状真菌，固态发酵是模拟真菌的天然生长条件[2]，因此特别适合培养丝状真菌产酶[3，4]。与液态深层发酵相比，它具有一些优点：发酵体系没有游离水存在，微生物是在其有足够湿度的固态底物上进行反应，底物则既不溶于水，也不悬浮于水中，同时也为微生物的生长提供了一个固定的位置，更有利于真菌的生长和产酶；可利用低值糠麸类和废渣类为原料进行生产，成本低、原料来源丰富；简化生产工艺，免去液体发酵需脱水、收集、干燥的复杂程序；在生产过程中，无废水、废气产生，固体颗粒间隙便于氧传质，通气量小，酶产率高等优点。缺点是发酵不均匀，菌体生长、营养物的吸收和代谢产物的分泌在各处都是不均匀的，使得发酵参数（pH，热，营养条件等）的检测和控制都比较困难，实现工业化困难。
2 木质素酶固态发酵的影响因素
2.1 基质
固态发酵最重要的是选择合适的基质。用于木质素酶生产的固态基质可分为两大类：惰性材料，它只作为微生物的固定载体；非惰性材料，不仅作为载体，还作为一些微生物生长需要的营养物质[5，6]。后者由于它们的双重作用，也被称为底物基质。这些材料主要是含淀粉基和纤维素基的农产品或农业资源，如谷类及其副产品[7]。它们不仅来源广泛，价格低廉，而且利用这些材料还能解决它们的废弃造成的环境和经济问题。基质的选择决定于所要产的酶，基质中还可能存在酶基因表达的诱导物质。陈洪章等[8]利用汽爆麦草固态发酵生产木质素酶。汽爆处理的纤维质原料，特别是草类原料，木质素已部分被降解，其降解产物可以替代昂贵的藜芦醇作为木质素酶基因表达的诱导剂。用于木素过氧化物酶生产的基质要选择木质素含量丰富的[9]，纤维素丰富的基质则有利于合成漆酶。


表1是用于木质素酶固态发酵基质的化学组成。固态发酵越来越多地应用于生产抗生素，表面活性剂，抗微生物剂和酶，特别是用固态发酵技术生产木质素酶。用惰性物质作基质固态发酵生产木质素酶的报道很少，尽管胞外产物与惰性基质分离方便，产物回收比非惰性基质体容易，而且产物纯度高[13]，它的缺点培养基成本高。利用天然材料如麦麸、木屑等做基质，尽管产物回收和纯化的成本很高，但天然材料的价格低廉，来源广泛，而且酶活性更高[14]，故目前广为使用。表2是各种木质素酶生产的基质，微生物等。

2.2 培养基含水量及空气湿度
水是发酵的主要媒质，基质含水量是决定固态发酵成功与否的关键因素之一[16]。木质素酶固态发酵基质含水量与水分活度有关, 维持发酵过程要求一定的水分含量，水分活度影响到真菌的生长状态, 也是大部分固态发酵反应器设计的重要考虑因素, 固态发酵中水分含量还影响到底物的物理状态, 营养物质的扩散及利用、氧和二氧化碳的交换等等,基质含水量大小值随菌种及原料而异, 发酵基质含水量的大小也影响到通风及传热、传质过程。徐福建等[17]通过正交试验发现，固态培养基的固液比对木质素酶的合成有很大的影响。
2.3 通气
微生物合成木质素酶是一个耗氧的过程[18]，因此在固态发酵过程中必须通入足够的氧气。通气量的大小主要取决于基质量和菌种生产状态, 许多真菌有浓密的菌丝体,会增加基质对气体流动的阻力，同时还影响到物料水分的蒸发。为了满足固态发酵过程氧的需求而进行强制通风, 在培养料中添加相对低活性的木质纤维素等滞留水能力强的基质, 可以避免由于强制通风等措施而引起蒸发的水分损失。

2.4 其它影响因素
对木质素酶生产有影响的因素还有温度，固态发酵系统放大设计的最大障碍也是研究如何较有效地去除发酵产生的热量, 因为固态基质热传导性差，导致热量对流及传热效率低下。
减小固体基质粒度可以有效的增加固体颗粒的比表面积，使空气更容易与固体颗粒有效的接触，同时也增加了容积密度；但颗粒间的距离的减小使通风变得比较困难，颗粒大小与通风量之间产生矛盾：小颗粒能增加比表面积,大颗粒能保证良好的通风发酵。
3 固态发酵生物反应器生产木质素酶
生物反应器的选择都需要考虑与其关系密切的参数，如通气，pH, 湿度，搅拌和温度等。和液态深层发酵相比，固态发酵的固态培养基水分含量少,气相多,而空气的热导率比水低的多。另外，固态发酵要用大量的基质，这些基质的化学组成、机械强度、孔隙率及持水量各不相同。固态发酵反应器的限制因素包括：氧传质、温度和固体培养基的含水量[19]。固态发酵反应器设计还需要考虑真菌的形态学和对机械搅拌的抗力。
木质素酶广泛应用于工业需要酶的大规模高效生产。用固态发酵产酶存在的困难是如何有效控制重要的培养参数，如传质和散热[20]。目前已经有多种生物反应器应用于固态发酵如：填充床，滚筒，气固流化床以及一些搅拌反应器[21]。利用木质纤维作为基质代替惰性基质进行反应器发酵还存在新问题：在长时间发酵过程中基质容易降解和粘连，导致传质和氧传递的限制。Rodrugyez课题组设计了多种固态发酵生物反应器来大规模生产木质素酶[22，23]。

3.1 浸没式生物反应器
它是一个有夹套的玻璃罐，下部装有液体培养基，尼龙载体置于金属丝筐中，随一个气动装置上下移动。MnP和LiP最高酶活分别达到987和356 U/l[24]。这个反应器还可以进行连续操作。以木质纤维作为载体，MnP 和LiP 酶活也达到803和509 U/l（图1a）。
3.2 填充床生物反应器
微生物和基质填充在一个有玻璃夹套的罐内，底部不断的通入湿空气（图1b）。

3.3 滚筒生物反应器
微生物和基质装在金属网做的圆筒内，圆筒在圆柱形的玻璃罐内慢慢滚动（<3r/min），培养基位于玻璃罐底部，当圆筒转动的时候，微生物和基质浸入到培养基中，同时，上半部分微生物和基质与空气接触，得到足够的氧气 (图1c)。
3.4 浅盘生物反应器
微生物和基质都放在浅盘上，厚度约1.5～2 cm。浅盘放在一个恒温的小室内，通气（图1d）。它最适合以麸皮做基质，用Trametes versicolor 合成漆酶[22]。


4 前景展望
鉴于木质素酶对底物的非特异性氧化能力，近年来，木质素酶在工业污染物处理中的应用逐渐成为热门的研究课题。纸浆和造纸、碳转化、印染以及橄榄油工业都是造成酚类污染的工业，它们排出的有色有毒物质会污染自然环境，引起严重的环境危害。传统的污染处理法不仅不能有效的降解这些物质，而且耗费巨大。木质素酶为低廉有效地处理这些工业污染物提供了可能。
固态发酵技术生产木质素酶最大的优势在于可以利用有机废物，如饲料工业、农业、林业和食品工业的残渣，作为原材料生产[25]。对有机废物加以综合利用，不但可以使废弃物变为有经济价值的资源，而且可以减轻环境污染，化害为利。另外，这些物质中的大部分含有丰富的木质素，可以作为木质素酶合成的诱导剂。而且它们还富含盐，可以使固态发酵过程更加经济。
木质素酶固态发酵过程中麦麸是应用最广泛的底物基质，但学者已经开始研究其它物质做基质。如利用水果皮作为底物基质生产漆酶。研究新型的高效固态发酵生物反应器，并研究反应参数的有效检测和控制技术，是目前木质素酶固态发酵的研究方向。如果能将固态发酵技术应用于木质素酶的大规模生产，必将有广阔的应用前景。
参考文献
1 Barr D P，Aust S D. Enzyme degradation of lignin[J]. Rev Environ Gantaninat Toxicol., 1994, (138):49～72

2 Pandey A, Selvakumar P, Soccol C R, et al. Solid state fermentation for the production of industrial enzymes[J]. Curr. Sci., 1999,(77):149～162
3 Pandey A, Azmi W, Singh J, et al. Types of fermentation and factors affecting it[M]. In: V.K. Joshi and A. Pandey, Editors.Biotechnology: Food Fermentation, Educational Publishers, New Delhi, 1999.383～426
4 Moo-Young M, Moreira A R, Tengerdy R P. Principles of solid sate fermentation[M]. In: J.E. Smith, D.R. Berry and B. Kristiansen, Editors, The Filamentous Fungi, Edward Arnold Publishers, London. 1983.117～144
5 Durand A, Renaud R, Almanza S, et al. Solid-state fermentation reactors: from lab scale to pilot plant[J].Biotechnology Advances,1993,11(3):591～597
6 Ralph B J. Solid substrate fermentations[J]. Food Technol. Aust.,1976,(28):247～251
7 Pandey A. Recent process developments in solid-state fermentation[J]. Process Biochemistry,1992,27(2):109～117
8 陈洪章, 李作虎, 陈继贞.汽爆麦草固态发酵木质素酶[J].应用与环境生物学报,　2000,6(2):191～193
9 S Rodríguez Couto, R Rodríguez, P P Gallego, et al. Biodegradation of grape cluster stems and ligninolytic enzyme production by Phanerochaete chrysosporium during semi-solid-state cultivation[J]. Acta Biotechnol., 2003,(23): 62～64
10 Cruz J M, Domínguez J M, Domínguez H. Preparation of fermentation media from agricultural wastes and their bioconversion into xylitol[J]. Food Biotechnol., 2000,(14): 79～97
11 A M Martin. Bioconversion of Waste Materials to Industrial Products[M]. Blackie Academic Professional, London ,1998
12 R Rodríguez. Utilización de residuos de la industria vitivinícola para su aprovechamiento[M]. Composición del bagazo de cv. Albariйo, Master Thesis, University of Vigo, Vigo, Spain, 1999
13 Ooijkaas L P, Weber F J, Buitelaar R, et al. Defined media and inert supports: their potential as solid-state fermentation production systems[J]. Trends in Biotechnology,2000,18(8):356～360
14 S Rodríguez Couto, E Rosales, M Gundín, et al. Exploitation of a waste from the brewing industry for laccase production by two Trametes sp [J]. J. Food Eng., 2004,(64):423～428
15 S. Rodríguez Couto, M A. Sanromán. Application of solid-state fermentation to ligninolytic enzyme production[J]. Biochemical Engineering Journal,2005,22(3): 211～219
16 Kiran Sree N, Sridhar M, Venkateswar Rao L,et al. Ethanol production in solid substrate fermentation using thermotolerant yeast[J]. Process Biochemistry, 1999, 34(2): 115～119
17 Xu F J, Chen H Z, Li Z. Solid-state production of lignin peroxidase (LiP) and manganese peroxidase (MnP) by Phanerochaete chrysosporium using steam-exploded straw as substrate[J]. Bioresource Technology ,2001,82(2): 149～151
18 Dosoretz C G, Chen A H C, Grethlein H E. Effect of oxygenation conditions on submerged cultures of P. chrysosporium [J]. App. Microbiol.Biotechnol., 1990,(34):131～137
19 Durand A. Bioreactor designs for solid state fermentation[J]. Biochemical Engineering Journal, 2003, 13(2～3): 113～125
20 Cohen R, Persky L, Hazan-Etian Z, et al. Mn2+ alters peroxidase profiles and lignin degradation by the white-rot fungus Pleurotus ostreatus under different nutritional and growth conditions[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology - Part A Enzyme Engineering and Biotechnology, 2002, (102～103): 415～429
21 Mitchell D A, Krieger N, Stuart D, et al. New developments in solid-state fermentation. II. Rational approaches to the design, operation and scale-up of bioreactors[J]. Process Biochemistry,2000,35(10): 1 211～1 225

22 S Rodríguez Couto, D Moldes, A Liébanas, et al. Investigation of several bioreactor configurations for laccase production by Trametes versicolor operating in solid-state conditions[J], Biochem. Eng. J., 2003,(15):21～26
23 Domínguez A, Rivela I, Rodríguez Couto S, et al. Design of a new rotating drum bioreactor for semi-solid-state processes. Application to ligninolytic enzyme production by Phanerochaete chrysosporium[J]. Process Biochemistry,2001,(37):549～554
24 Mitchell D A, O.F. von Meien, Krieger N, et al. A review of recent developments in modeling of microbial growth kinetics and intraparticle phenomena in solid-state fermentation[J]. Biochemical Engineering Journal,2004,17(1):15～26
25 Kalogeris E, Iniotaki F, Topakas E, et al. Performance of an intermittent agitation rotating drum type bioreactor for solid-state fermentation of wheat straw[J]. Bioresource Technology,2003,86(3):207～213

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