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巴斯德毕赤酵母表达系统及其在饲料添加剂开发上的应用前景
日期：2006-4-13 10:48:00 来源：河南畜牧网 主题：巴斯德毕赤酵母表达系统及其在饲料添加剂开发上的应用前景
作者:许英蕾 孙建义 刘明启
摘 要 经过近15年来的不断开发和完善，巴斯德毕赤酵母已经成为目前最成功的酵母表达系统之一。由于该酵母具有高水平表达的潜力和能进行高密度发酵，它的大规模发酵可用于生产多种新的蛋白。一些生长激素、酶、抗菌肽在毕赤酵母中的成功表达展示了该表达系统在饲料添加剂开发上的广阔应用前景。
1 前言
酵母作为表达外源重组蛋白的宿主，长期倍受人们的青睐。这是因为作为一种真核生物，酵母对所表达的外源蛋白进行翻译后加工、分泌，使表达产物与它们的天然蛋白形式相似或相同；而作为一种菌类，酵母又能象细菌一样可以在廉价的培养基上大量繁殖。最早开发用于生产重组蛋白的酵母为酿酒酵母（Peter E Sudbery,1996）。虽然，酿酒酵母具有以上的优点，但是由于其表达量低、重组菌株在有丝分裂时的不稳定性、表达产物的超糖基化和难以产业化生产等缺点限制了它的发展（Cornelis P Hollenberg等，1997）。近十年来一些甲醇营养型酵母，迅速发展成为新的表达系统逐渐替代酿酒酵母的主导地位，巴斯德毕赤酵母就是其中之一。
随着巴斯德毕赤酵母的乙醇氧化酶（AOX）启动子PAOX1的分离和克隆，巴斯德毕赤酵母被发展成为一个生产外源蛋白的优秀宿主。巴斯德毕赤酵母代谢甲醇的第一步是在AOX的催化下进行的。PAOX1是严格调控AOX1基因表达的强启动子，它可以诱导单拷贝的AOX1基因产生占细胞总蛋白30%的醇氧化酶。该启动子在用甲醇为碳源时被强烈诱导，在采用其它碳源时则被抑制。因此在巴斯德毕赤酵母表达系统中由PAOX1控制的外源蛋白基因在甲醇的诱导下能得到较高的表达量。巴斯德毕赤酵母表达系统的另一个主要特点是它在高密度发酵时依然能实现高水平表达，大多数表达产物正确折叠后能分泌到培养基中（Yinliang Chen等，1997）。因此采用巴斯德毕赤酵母发酵生产外源蛋白具有广阔的应用前景。
2 转化子的形成与筛选
2.1 外源基因插入表达载体
巴斯德毕赤酵母表达系统中大部分的载体都是既可以在大肠杆菌中扩增，又可以整合入巴斯德毕赤酵母基因组中的大肠杆菌/毕赤酵母穿梭载体。因此它们都具有一个可在大肠杆菌中复制的原点和一些可作用于巴斯德毕赤酵母或/和大肠杆菌的标记。绝大部分的表达载体都有一个表达元件，这个元件有一个AOX1启动子（PAOX1）和一个从AOX1基因上拷贝下来的终止序列（TT）。在启动子和终止子序列之间是用于插入外源基因的多克隆位点（MCS）(Joan Lin Cereghino等，2000)。一般来说外源基因的起始密码离AOX1的起始密码越近越好。因此在插入外源基因时，尽量要用MCS最前面的限制性酶切位点。
2.2 表达载体整合入巴士德毕赤酵母基因组
携带外源基因的表达载体被酶切后形成dsDNA导入宿主细胞，并整合入巴斯德毕赤酵母基因组中。表达载体可以两种方式整合入巴斯德毕赤酵母基因组。若线性化的载体DNA 片段与基因组的AOX1两端都具有同源性，则载体DNA取代AOX1基因。若载体在线性化过程中被切于PAOX1的5’端或切于HIS4标志之中，则载体直接整合入基因组的同源位点中。基因替代一般只形成单拷贝转化子，而直接整合可以形成多拷贝转化子，当然也存在假阳性即转化子中不含有载体基因无法表达外源蛋白仅载体的标志基因如HIS4整合入突变位点（Mike Romanos，1995）。
大多数巴斯德毕赤酵母是通过对野生型的石油酵母Y11430进行突变改造而来的。它们一般具有一个或多个营养缺陷型突变基因，这些基因被含有相应选择标记基因的表达载体所识别。若表达元件插入HIS4基因，则产生甲醇利用正表型（Mut+）这种菌株含有AOX1和AOX2基因，在含甲醇的培养基内生长正常。但是这种菌株对甲醇浓度非常敏感，甲醇浓度突然提高，易使AOX的活力丧失，甚至使细胞死亡，因此一般先让巴斯德毕赤酵母先在含甘油（抑制PAOX1的碳源）的培养基上生长，然后通过逐步添加甲醇来诱导外源基因表达（Mehment Inan等，1999）。若表达元件直接插入酵母基因组的AOX1位点，使该基因断裂，只剩AOX2基因。虽然AOX2与AOX1有97%的同源性，但是AOX2的基因产物只占醇氧化酶活力的一小部分，因此该菌株在含有甲醇的培养基上生长缓慢。这种菌株就为甲醇利用慢表型（Muts）。虽然Muts对甲醇不敏感，但是由于其诱导时间较长，生产率低，容易大规模扩增，甚至可以获得高产量的产物。当AOX1、AOX2基因都被PAOX1调节下的LacZ基因取代无法编码醇氧化酶时则产生甲醇利用负表型（Mut-），这种菌株无法在含有甲醇的培养基中生长。但若采用控制补料的方法逐渐补充抑制PAOX1的碳源诸如甘油等，会降低碳源的抑制效应，从而使该菌株获得一定的发酵密度。
表达载体可以通过原生质球法、电转法、PEG法和醋酸锂法导入宿主细胞。PEG和醋酸锂法转化效率低，每微克DNA只有几十个转化子，而原生质法费时，不值得推荐。电转法因其简便、迅速而被广为使用（张艳等，2002）。
2.3 转化子的筛选
转化子筛选的主要目的在于能找出高效表达外源蛋白的克隆子。外源蛋白的表达水平在很大程度上受基因拷贝数的影响，对有些蛋白而言单拷贝的表达元件足够可以将其有效表达出来。但对于另外的一些蛋白如人类的肿瘤坏死因子（K.Sreekrishna等，1989）等而言，提高表达元件的拷贝数对高效表达来说是必须的。因此，基因拷贝数对表达的效应是无法预计的。具体的筛选方法视转化方法而定（Nikolay S. Outchkourov等，2002）。用原生质球法对巴斯德毕赤酵母进行转化可以得到含有大范围不同拷贝数的转化子，我们只要对其中100个左右的转化子进行分泌水平的分析就可以找出高效表达的转化子；若是用一些不能高频率产生多基因拷贝转化子的转化方法如电转导或LiCl法，那就需要采用一些比较高效的筛选法如用DNA探针进行菌落纯化或斑点印迹分析；或在抗生素抗性水平提高的基础上进行筛选。
3 分泌表达与细胞内表达
所表达的蛋白是存在于胞内还是分泌到胞外与信号肽的存在与否有关。在巴斯德毕赤酵母中分泌表达是一种理想的蛋白生产方式。这是因为巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，培养基中也几乎不含其它的蛋白质，这样，分泌的蛋白占了培养基中总蛋白的绝大部分，十分有利于外源蛋白的分离和纯化。但是不适合的信号肽会导致信号肽加工不完全，或蛋白分泌水平低甚至不分泌。有一些外源蛋白可以用它们天然的信号肽从巴斯德毕赤酵母细胞中成功地分泌出来。然而，有些蛋白如FSHβ（Mitali Samaddar等，1997）采用酵母信号肽的分泌水平比使用自身天然信号肽的分泌水平高20～30倍。一般来说，采用酵母信号肽易使表达成功。目前在巴士德毕赤酵母分泌表达中应用最为成功的酵母信号肽为 S.cerevisiea 来源的α性成熟因子（α-MF）序列。一些商业生产的巴斯德毕赤酵母表达载体如pPIC9系列、pPICZ系列等中已经包含有该α因子基因序列（Geoff P Lin Cereghino等，2002）。
4 在饲料添加剂开发上的应用前景
经过十多年的发展，巴斯德毕赤酵母已经成为比较完善的外源蛋白表达系统。同时巴斯德毕赤酵母的工业发酵工艺也已经发展的比较成熟。目前大约已经有４００多种的蛋白在该系统中获得表达。有些甚至形成了产业化，产生了巨大的经济效益，如医药上开始用毕赤酵母生产一些抗原疫苗、激素、干扰素等。一些激素、酶、抗菌肽在巴斯德毕赤酵母中的成功表达显示了该酵母在饲料添加剂的开发上具有广阔的应用前景。
4.1 激素
一种猪的重组生长激素（rGH）基因已经在巴斯德毕赤酵母中获得表达，其表达量大于总酵母蛋白的20%。用按梯度（0.05%、0.1%、0.2%、0.4%）添加有该酵母培养物的基础日粮喂养土鸡发现：与对照组相比，饲喂含0.1%、0.2%酵母培养物日粮的土鸡在育雏阶段的体增重非常明显；饲喂含0.4%酵母培养物日粮的土鸡在生长阶段的体增重非常明显（P<0.05）(Chuan-Mu Chen等，2000)。李英华等（2001）用巴斯德毕赤酵母胞内表达鲤鱼生长激素（rcGH），并将所构建的工程菌作为饲料添加剂饲喂罗非鱼，发现具有强烈的促生长作用。
4.2 酶
在巴斯德毕赤酵母中获得高效表达的促消化的酶类有α-淀粉酶（Nathalie Juge等，1996）、脂肪酶（Stefan Minning等，2001）等。一些能提高饲料利用率的酶如不同来源的植酸酶（Eric Rodriguez等，2000）和真菌的β-1，4-内切木聚糖酶（Jean-Guy Berrin等，2000）也已经在巴斯德毕赤酵母中表达成功。目前这些酶的基因改造正在广泛开展，经基因改造后的酶将不仅具有良好的热稳定性，在饲料高温制粒中的损失小，而且在动物的消化道中不易被降解，结合巴斯德毕赤酵母的营养要求低，生长快，培养基廉价，能高密度发酵生长等优点为廉价有效地生产优质饲料酶制剂提供了新的思路。
4.3 抗菌肽
抗菌肽是生物体产生的一种具有抗菌活性的多肽，它分子量小、抗菌谱广且效率高，作用机制独特，不易产生抗性。在抗生素对畜产品的品质和人类健康的影响日趋严重的情况下，抗菌肽极有可能替代抗生素成为新的抗菌药物饲料添加剂来源。由于抗菌肽对细菌具有很强的杀伤作用，不易在原核系统中直接表达，一般采用融合表达或在酵母中表达。在巴斯德毕赤酵母中获得表达的抗菌肽有：蛙皮素（陈海旭等，2002）、抗菌肽AD（黄亚东等，2002）、抗菌肽ApiIa（韩万江等，1998）、抗菌肽ABP3（沈俊清等，1999）等。随着抗菌肽在巴斯德毕赤酵母中表达研究的开展，抗菌肽的生产成本将大大降低，为其在饲料中的应用展示了广阔的前景。
参考文献
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