反刍动物酶制剂适宜配比及添加量的研究
时间:2006-04-13 来源:河南畜牧网 作者:admin 点击：
作者:瞿明仁 唐志强 卢德勋
饲用酶制剂的开发和应用是生物技术在动物营养和饲料工业中应用最为成功的例子。它在提高动物生产性能和饲料利用效率，开发新的饲料资源，生产无毒、无残留、天然的畜产品以及环境保护等方面逐渐显示出巨大的潜力。以前，在反刍动物饲养中的
作者:瞿明仁 唐志强 卢德勋
饲用酶制剂的开发和应用是生物技术在动物营养和饲料工业中应用最为成功的例子。它在提高动物生产性能和饲料利用效率，开发新的饲料资源，生产无毒、无残留、天然的畜产品以及环境保护等方面逐渐显示出巨大的潜力。以前，在反刍动物饲养中的应用酶制剂研究很少，因为人们认为瘤胃内的微生物活动很多，可分泌大量的酶，而且认为外源酶在瘤胃中被蛋白酶所水解或受小肠蛋白酶的作用而失活。最近研究发现纤维素酶、半纤维素酶在蛋白酶温育的过程中相当稳定；木聚糖酶可抵抗数种蛋白酶的水解[1]。这再次引起了在反刍动物日粮中添加复合酶的兴趣。另外，随着生物工程技术的发展，给酶制剂生产领域带来了新的发展机遇，一些酶制剂的活力和产量有所提高，酶制剂的稳定性和可用性随之提高，这些有利因素使得酶制剂在反刍动物日粮中的应用成为可能。为此进行反刍动物酶制剂适宜配比及添加量的研究，旨在筛选出适宜的酶配方及添加量，应用于反刍动物生产中。
1 材料和方法
1.1 试验设计
试验一、根据目前反刍动物酶制剂应用研究进展，确定纤维素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶等5种单一酶作为酶制剂配比的原料，每种酶设高、低两个水平，按正交试验设计，即采用L8（27）正交表[2]，总共分A、B、C、D、E、F、G、H等8个配比组合，另设一个对照组（T）（即不加任何酶制剂），每个组合设3个平行样。具体设计见表1。
试验二、根据试验一得出的结果，按照单因子设计，将最佳酶配比组合设6个水平（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），即设6个试验组，另设一个对照组（不加任何酶），每一个组设3个平行样。
1.2 试验方法
采用体外批次培养法，培养时间为24h，在体外 批次培养饲料条件下，研究5种酶的8种不同组合对体外瘤胃微生物发酵的影响。具体试验方法：先按正交试验设计中的酶水平配制各个酶组合，再按0.1%酶制剂与体外批次培养饲料混匀，一起装进培养瓶内，然后加20ml瘤胃液和40ml缓冲液，在体外培养装置中进行振荡培养。体外批次培养饲料配方见表2（体外批次培养装置、缓冲液配制参见杨永明硕士论文[3]）。本日粮配方精粗比为3：7，为玉米—豆粕—青干草型日粮。
1.3 瘤胃液供体羊及饲养管理
选取4只健康的带有永久性瘤胃瘘管的内蒙古半细毛羯羊。试验动物在7：00和19：00分两次饲喂，定量饲喂，日喂量900g。试验前驱虫，单笼饲养，自由饮水，自由光照。
1.4 瘤胃液供体羊日粮
1.5 试验酶制剂及其酶活
试验所用的5种酶（纤维素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶）均由广东溢多利生物科技有限公司提供，各酶的酶活按溢多利公司提供的企业标准方法测定，酶活见表4。
1.6 瘤胃液的采集
早晨饲喂后2h从4头瘤胃液供体羊采集瘤胃液，将其灌入经39℃预热、并通有CO2的保温瓶中，灌满后立即盖严瓶口，迅速返回实验室。厌氧条件下经4层纱布过滤，持续充入CO2气体5min，然后迅速分装至上述已预热的厌氧培养瓶内，每个培养瓶加入瘤胃液20ml，进行培养。
1.7 测定指标与测定方法
1.7.1 挥发性脂肪酸（VFA）
用日本岛津GC-7A气相色谱仪内标法进行测定。内标物为巴豆酸。测定过程为：取双层纱布过滤后的培养液10ml，在3 500r/min条件下离心15min，取4ml上清液，加入1ml 25%偏磷酸（质量：体积），摇匀静置30min以上（假如不能立即测定，应置于冰箱中低温保存），取该混合液1ml加入预先装有2g酸性吸附剂（酸性吸附剂：每100g酸性吸附剂含无水硫酸钠60g，50%硫酸2ml，硅藻土40g。）的离心管内，再加入4ml巴豆酸溶液（31.25mM/l，溶剂为CHCl3），摇匀，澄清后，取1ml上机测定。
色谱条件:色谱柱内径为3mm,长2m的不锈钢柱，柱温150℃，汽化室温为230℃，担体为Chromsob W(AW)（酸性硅藻土）重量10%的FFAP（聚乙醇与2-硝基对苯二甲基的反应物）与1%的H3PO4（优级醇）。空气压力为0.35kg/cm2，流量为140ml/min；氢气压力为1.2kg/cm2，流量为14ml/min；氮气压力为1.75kg/cm2，流量为55ml/min。进样量为1μl。
1.7.2 中性洗涤纤维（NDF）
培养完毕后，将培养瓶内的内容物全部转移到离心管内，在3 500r/min、15min的前提下离心，离心完毕后将上清液倒去，将下层沉积物转移到小瓷碗中60～65℃烘至恒重待测。NDF的测定方法按照杨胜主编的《饲料分析与饲料质量检测技术》（1991）进行。
1.8 数据统计与分析
试验数据统计和分析利用SAS（8.0）软件包中的ANOVA和DUNCAN程序进行。
2 结果与分析
2.1 不同酶制剂配比组合对NDF和VFA 的影响
试验结果见表5。从表5的试验结果可知：试验各组合的VFA产量与对照组相比，除G、H组有显著降低（P<0.05）外，其余各组都有一定的提高，但差异均不显著（P>0.05），但H组与B、C组有显著差异（P<0.05）。总的来看以试验组合B和C的VFA产量最高；各组合的NDF含量较对照组均有一定的降低，但只有组合C、D与对照组差异显著（P<0.05），C组合NDF最低且与对照组差异极显著（P<0.01）。
因此，根据VFA产量与NDF降低结果判断，组合C为最佳组合。即“纤维素酶：木聚糖酶：酸性蛋白酶：中性蛋白酶：α-淀粉酶=低：高：高：低：高”为最佳组合。
2.2 不同水平酶制剂对NDF和VFA的影响
从表6的试验结果可知：试验各水平的VFA产量与对照组相比有增高的趋势，但各组之间差异不显著，但以0.2%水平组产量最高；试验各水平的NDF含量较对照组均有显著降低，且以0.2%水平组含量最低。
因此，根据VFA产量和NDF降低结果，0.2%水平组为最佳添加量。
3 讨论
由于瘤胃内微生物能产生大量的纤维素酶，足可以保证纤维素降解需要，所以在所有的组合中，高水平纤维素酶的组合如E、F、G、H对NDF的降解都不理想。而添加高水平的木聚糖酶组合C、D、G对NDF的降解率较高，这可能是瘤胃微生物产生的木聚糖酶不足，适当添加木聚糖酶可提高NDF的降解。就单个高水平的酶对VFA的影响，很难得出规律，但就组合而言，以组合B、C的VFA产量最高，这是各种酶与酶之间组合效应综合作用的结果。目前，一些酶组合研究结果表明恰当的酶组合是发挥酶最大功效的关键因素。朱元招等[4]（2001）在补饲不同配方酶制剂对犊牛断奶后生产性能的影响试验中，添加两种不同配方的酶制剂，酶制剂E1由纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和淀粉酶组成，E2由木聚糖酶、果胶酶、蛋白酶和淀粉酶组成，两组酶配方中，以纤维素酶为主的E1效果优于E2。Malathi和Devegowda（2001）[5]用体外法研究了3种复合酶：复合酶1（戊聚糖酶+纤维素酶）、复合酶2（戊聚糖酶+纤维素酶+β-葡聚糖酶）、复合酶3（戊聚糖酶+纤维素酶+β-葡聚糖酶+果胶酶）对玉米、高粱、小米、米糠、豆粕、花生饼、太阳瓜子饼和菜籽饼等饲料原料溶液的粘度及总糖的释放量，研究表明，复合酶3使各种原料在体外的消化率达到最高。本试验首次通过体外培养试验对纤维素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等5种进行筛选出“纤维素酶：木聚糖酶：酸性蛋白酶：中性蛋白酶：α-淀粉酶=低：高：高：低：高”为最佳组合，并在此基础上得出了适宜的添加量。这对研制应用于反刍动物适宜的复合酶制剂具有参考价值。诚然，体外条件与体内条件差别较大，体外法得出的最佳酶组合及添加量不能反映体内的真实情况。今后还需要进行体内试验。只有用体内与体外结合的方法，才能得出科学的适用于反刍动物的复合酶制剂。
参考文献
1 Fontes, C. M. G. A., J. T. Hall, B. H. Hirst, G. P. Hazelwood, and H. J. Gilbert. The resistance of cellulases and xylanases to proteolytic inavtivation. APP, Microbuol. biotechnol, 1995, (43):52～57
2 贵州农学院主编. 生物统计附试验设计. 农业出版社， 1993
3 杨永明. 外源纤维复合酶在绵羊饲养中的作用效果及其作用机制的研究. 内蒙古农业大学硕士论文，2002
4 朱元招，韩定忠，刘亚力. 补饲不同配方酶制剂对犊牛断奶后生产性能的影晌. 黄牛杂志，2001，27（3）：29～31
5 V. Malathi and G. Devegowda. In Vitro Evaluation of Nonstarch Polysaccharide Digestibility of Feed Ingredients by Enzymes. Poultry Science, 2001, (80):302～305
饲料工业
饲用酶制剂的开发和应用是生物技术在动物营养和饲料工业中应用最为成功的例子。它在提高动物生产性能和饲料利用效率，开发新的饲料资源，生产无毒、无残留、天然的畜产品以及环境保护等方面逐渐显示出巨大的潜力。以前，在反刍动物饲养中的应用酶制剂研究很少，因为人们认为瘤胃内的微生物活动很多，可分泌大量的酶，而且认为外源酶在瘤胃中被蛋白酶所水解或受小肠蛋白酶的作用而失活。最近研究发现纤维素酶、半纤维素酶在蛋白酶温育的过程中相当稳定；木聚糖酶可抵抗数种蛋白酶的水解[1]。这再次引起了在反刍动物日粮中添加复合酶的兴趣。另外，随着生物工程技术的发展，给酶制剂生产领域带来了新的发展机遇，一些酶制剂的活力和产量有所提高，酶制剂的稳定性和可用性随之提高，这些有利因素使得酶制剂在反刍动物日粮中的应用成为可能。为此进行反刍动物酶制剂适宜配比及添加量的研究，旨在筛选出适宜的酶配方及添加量，应用于反刍动物生产中。
1 材料和方法
1.1 试验设计
试验一、根据目前反刍动物酶制剂应用研究进展，确定纤维素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶等5种单一酶作为酶制剂配比的原料，每种酶设高、低两个水平，按正交试验设计，即采用L8（27）正交表[2]，总共分A、B、C、D、E、F、G、H等8个配比组合，另设一个对照组（T）（即不加任何酶制剂），每个组合设3个平行样。具体设计见表1。
试验二、根据试验一得出的结果，按照单因子设计，将最佳酶配比组合设6个水平（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），即设6个试验组，另设一个对照组（不加任何酶），每一个组设3个平行样。
1.2 试验方法
采用体外批次培养法，培养时间为24h，在体外 批次培养饲料条件下，研究5种酶的8种不同组合对体外瘤胃微生物发酵的影响。具体试验方法：先按正交试验设计中的酶水平配制各个酶组合，再按0.1%酶制剂与体外批次培养饲料混匀，一起装进培养瓶内，然后加20ml瘤胃液和40ml缓冲液，在体外培养装置中进行振荡培养。体外批次培养饲料配方见表2（体外批次培养装置、缓冲液配制参见杨永明硕士论文[3]）。本日粮配方精粗比为3：7，为玉米—豆粕—青干草型日粮。
1.3 瘤胃液供体羊及饲养管理
选取4只健康的带有永久性瘤胃瘘管的内蒙古半细毛羯羊。试验动物在7：00和19：00分两次饲喂，定量饲喂，日喂量900g。试验前驱虫，单笼饲养，自由饮水，自由光照。
1.4 瘤胃液供体羊日粮
1.5 试验酶制剂及其酶活
试验所用的5种酶（纤维素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶）均由广东溢多利生物科技有限公司提供，各酶的酶活按溢多利公司提供的企业标准方法测定，酶活见表4。
1.6 瘤胃液的采集
早晨饲喂后2h从4头瘤胃液供体羊采集瘤胃液，将其灌入经39℃预热、并通有CO2的保温瓶中，灌满后立即盖严瓶口，迅速返回实验室。厌氧条件下经4层纱布过滤，持续充入CO2气体5min，然后迅速分装至上述已预热的厌氧培养瓶内，每个培养瓶加入瘤胃液20ml，进行培养。
1.7 测定指标与测定方法
1.7.1 挥发性脂肪酸（VFA）
用日本岛津GC-7A气相色谱仪内标法进行测定。内标物为巴豆酸。测定过程为：取双层纱布过滤后的培养液10ml，在3 500r/min条件下离心15min，取4ml上清液，加入1ml 25%偏磷酸（质量：体积），摇匀静置30min以上（假如不能立即测定，应置于冰箱中低温保存），取该混合液1ml加入预先装有2g酸性吸附剂（酸性吸附剂：每100g酸性吸附剂含无水硫酸钠60g，50%硫酸2ml，硅藻土40g。）的离心管内，再加入4ml巴豆酸溶液（31.25mM/l，溶剂为CHCl3），摇匀，澄清后，取1ml上机测定。
色谱条件:色谱柱内径为3mm,长2m的不锈钢柱，柱温150℃，汽化室温为230℃，担体为Chromsob W(AW)（酸性硅藻土）重量10%的FFAP（聚乙醇与2-硝基对苯二甲基的反应物）与1%的H3PO4（优级醇）。空气压力为0.35kg/cm2，流量为140ml/min；氢气压力为1.2kg/cm2，流量为14ml/min；氮气压力为1.75kg/cm2，流量为55ml/min。进样量为1μl。
1.7.2 中性洗涤纤维（NDF）
培养完毕后，将培养瓶内的内容物全部转移到离心管内，在3 500r/min、15min的前提下离心，离心完毕后将上清液倒去，将下层沉积物转移到小瓷碗中60～65℃烘至恒重待测。NDF的测定方法按照杨胜主编的《饲料分析与饲料质量检测技术》（1991）进行。
1.8 数据统计与分析
试验数据统计和分析利用SAS（8.0）软件包中的ANOVA和DUNCAN程序进行。
2 结果与分析
2.1 不同酶制剂配比组合对NDF和VFA 的影响
试验结果见表5。从表5的试验结果可知：试验各组合的VFA产量与对照组相比，除G、H组有显著降低（P<0.05）外，其余各组都有一定的提高，但差异均不显著（P>0.05），但H组与B、C组有显著差异（P<0.05）。总的来看以试验组合B和C的VFA产量最高；各组合的NDF含量较对照组均有一定的降低，但只有组合C、D与对照组差异显著（P<0.05），C组合NDF最低且与对照组差异极显著（P<0.01）。
因此，根据VFA产量与NDF降低结果判断，组合C为最佳组合。即“纤维素酶：木聚糖酶：酸性蛋白酶：中性蛋白酶：α-淀粉酶=低：高：高：低：高”为最佳组合。
2.2 不同水平酶制剂对NDF和VFA的影响
从表6的试验结果可知：试验各水平的VFA产量与对照组相比有增高的趋势，但各组之间差异不显著，但以0.2%水平组产量最高；试验各水平的NDF含量较对照组均有显著降低，且以0.2%水平组含量最低。
因此，根据VFA产量和NDF降低结果，0.2%水平组为最佳添加量。
3 讨论
由于瘤胃内微生物能产生大量的纤维素酶，足可以保证纤维素降解需要，所以在所有的组合中，高水平纤维素酶的组合如E、F、G、H对NDF的降解都不理想。而添加高水平的木聚糖酶组合C、D、G对NDF的降解率较高，这可能是瘤胃微生物产生的木聚糖酶不足，适当添加木聚糖酶可提高NDF的降解。就单个高水平的酶对VFA的影响，很难得出规律，但就组合而言，以组合B、C的VFA产量最高，这是各种酶与酶之间组合效应综合作用的结果。目前，一些酶组合研究结果表明恰当的酶组合是发挥酶最大功效的关键因素。朱元招等[4]（2001）在补饲不同配方酶制剂对犊牛断奶后生产性能的影响试验中，添加两种不同配方的酶制剂，酶制剂E1由纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和淀粉酶组成，E2由木聚糖酶、果胶酶、蛋白酶和淀粉酶组成，两组酶配方中，以纤维素酶为主的E1效果优于E2。Malathi和Devegowda（2001）[5]用体外法研究了3种复合酶：复合酶1（戊聚糖酶+纤维素酶）、复合酶2（戊聚糖酶+纤维素酶+β-葡聚糖酶）、复合酶3（戊聚糖酶+纤维素酶+β-葡聚糖酶+果胶酶）对玉米、高粱、小米、米糠、豆粕、花生饼、太阳瓜子饼和菜籽饼等饲料原料溶液的粘度及总糖的释放量，研究表明，复合酶3使各种原料在体外的消化率达到最高。本试验首次通过体外培养试验对纤维素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等5种进行筛选出“纤维素酶：木聚糖酶：酸性蛋白酶：中性蛋白酶：α-淀粉酶=低：高：高：低：高”为最佳组合，并在此基础上得出了适宜的添加量。这对研制应用于反刍动物适宜的复合酶制剂具有参考价值。诚然，体外条件与体内条件差别较大，体外法得出的最佳酶组合及添加量不能反映体内的真实情况。今后还需要进行体内试验。只有用体内与体外结合的方法，才能得出科学的适用于反刍动物的复合酶制剂。
参考文献
1 Fontes, C. M. G. A., J. T. Hall, B. H. Hirst, G. P. Hazelwood, and H. J. Gilbert. The resistance of cellulases and xylanases to proteolytic inavtivation. APP, Microbuol. biotechnol, 1995, (43):52～57
2 贵州农学院主编. 生物统计附试验设计. 农业出版社， 1993
3 杨永明. 外源纤维复合酶在绵羊饲养中的作用效果及其作用机制的研究. 内蒙古农业大学硕士论文，2002
4 朱元招，韩定忠，刘亚力. 补饲不同配方酶制剂对犊牛断奶后生产性能的影晌. 黄牛杂志，2001，27（3）：29～31
5 V. Malathi and G. Devegowda. In Vitro Evaluation of Nonstarch Polysaccharide Digestibility of Feed Ingredients by Enzymes. Poultry Science, 2001, (80):302～305
饲料工业
