不同的处理条件对植酸酶活力的影响
摘 要 242个饲料样品被分为试验和对照两组，每组分为121个样品。试验组选用层析柱来浓缩酶以去除原酶液中的底色对测定结果的影响，对照组选用原酶液。结果表明，层析柱虽可去除底色的副作用，但对测定植酸酶的活力无任何影响（P>0.05）。在制颗粒料过程中，随着制粒温度的升高（60、70、80℃），植酸酶的活力丢失也愈多(P<0.01)。当用柠檬酸和醋酸两种缓冲液来浸提和测定植酸酶时，以柠檬酸缓冲液测得的植酸酶活力较低（pH5.5,P<0.01）。不同的浸提温度（4、25℃）及不同的浸提时间（5、10、15、30、45、60、90和120min）对测得的植酸酶活力皆无明显的影响(P>0.05), 因而植酸酶适宜的浸提温度和时间分别为25℃和60min。
关键词 植酸酶活力层析柱浸提时间制粒温度缓冲液
植酸是植物的主要磷源，其含量为0.5%~1.4%。它是一个重要的抗营养因子，它与氨基酸（赖氨酸、组氨酸和精氨酸等）、矿物元素和淀粉等营养物质发生螯合作用，从而影响这些营养物质的吸收利用(Selle, 1997)[1]。植酸酶可分解植酸，从而降低其抗营养作用，提高有机磷的利用率，降低其排放量达到改善环境污染的目的。当测定植酸酶活时，我们常常遇到各种各样的问题①是原酶液的底色对测定结果的副作用，这种影响常使反应终产物的颜色极深，使吸光度偏高，影响测定结果的准确性。一些公司和科研工作者逐步选用层析柱来浓缩酶液及去除底色对测定结果的影响，但由于此项工作费钱费时（2h以上），是否被选作一个测定植酸酶活的附加标准有待于进一步研究②是酶浸提时间对测定酶活的准确性影响，一般而言，浸提时间愈长，可使更多的植酸酶溶解于缓冲液中，但时间过长将会浪费更多的时间，因而选择适宜浸提时间变得愈来愈重要③是缓冲液选用皆需要标准化，否则无法进行横向比较。另外，Wyss(1998)[2]建议的制粒温度为60~85℃，制粒的温度愈低保存的酶活愈多，但固化差、易碎，制粒温度愈高虽然固化好，但丢失的酶活又多。因而如何解决好上述问题，对于植酸酶测定的标准化制定具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 植酸酶活力的测定
准确地称取5g（±0.01）饲料放入250ml的的三角瓶内，然后加入0.2M的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)，搅拌1h，然后在4℃、12 000r/min下离心20min。吸取上清液，利用与注射器相匹配的过滤器（孔经0.2μm、Pall Gelman公司生产、Ann Arbor,MI 48103-9019,USA）以去除上清液中微小颗粒对测定结果的影响。植酸酶活力的测定方法如下：取稀释液0.5ml放于试管内，然后放于37℃的水浴中预热5min，加入0.5ml 1%的植酸钠（以PH为5.5的0.2M的柠檬酸-柠檬酸钠为稀释剂），在37℃下反应15min。最后加入15%的三氯醋酸2ml以终止反应。1个单位的植酸酶活指1min内从植酸钠中分解出其1pmol的无机磷。。
1.2 层析柱在测定植酸酶活力上的应用
取由上一步制得的酶液0.5ml放入到微离心过滤器中（层析柱，由美国Millipore公司生产），在12 000r/min下室温离心约12min直到0.1~0.2ml的酶液残留（柱子千万不能干以免膜被损坏）。利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冲洗2次（pH5.5），最后定容体积为0.5ml。
1.3 制粒
制粒的温度分别为60、70和80℃，没经制粒的粉料作为对照组。所有的样品经60目筛子后用作植酸酶分析。
1.4 植酸酶浸提的时间
5g的样品放于250ml三角瓶中与50ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH5.5）混合，分别在4℃和25℃下搅拌5、15、30、45、60、90和120min。在每个时间点取样4ml，样品立即放入冰中保存，收集后的样品在12 000r/min下离心5min，上清液放于冰中用于植酸酶活力分析用。
1.5 统计分析
SAS（1992）软件用作统计分析用。
2 结果与讨论
2.1 层析柱的应用与植酸酶活力测定
试验结果表明虽然层析柱可以去除酶液的底色对试验结果影响的副作用，但在饲料植酸酶含量在0~1U/g之间时，层析柱的应用对测定结果无任何影响(P>0.05)。因而层析柱不被推荐用于植酸酶活力测定过程中，对于底色影响大的样品，通过加大样品的稀释度来减少底色的影响。当然对于底色影响较大的特殊饲料，如果酶活力低且过度稀释会超出标准曲线的范围，此时不妨选用层析柱来冲洗或浓缩。
2.2 制粒温度与植酸酶活力
本研究表明，随着制粒温度的升高（60~80℃），其酶活力将随着下降（P<0.01）。其原因是高温破坏了酶蛋白的结构而使酶失活所致。Wyss等（1998）报道，当制粒温度为80℃时仍能保持50%的酶活。本研究表明，60℃时只有48%~58%的酶活残留，而加热到80℃时仅有2%~15%酶活存留（见图1）。因而为了保存较多的酶活，可选用增加酶添加量及添加耐温物质(脂肪等)以保存酶以免高温失活。现在瑞士的Roche公司生产的商品植酸酶就是在产品中加入一种特殊耐热物质来包裹和保护植酸酶, 使颗粒状的植酸酶在80℃仍保持98%的活力
