饲料中莱克多巴胺的HPLC法测定

　　摘 要 用碱性甲醇提取试样中的莱克多巴胺，经SLA固相萃取柱净化，浓缩后用2％乙酸溶液定容，过膜后用高效液相色谱－荧光检测法分离测定；色谱柱类型Waters Symmetry C18柱，250mm×4.6mm（i.d.），粒径5μm；流动相为戊烷磺酸钠溶液∶乙腈(体积比80∶20)；激发波长为226nm，发射波长为306nm；流速1ml／min；进样量50μl；饲料中莱克多巴胺的检测限为0.5mg/kg；莱克多巴胺的测定在0.02～0.50μg／ml范围内具有良好的线性关系，平均回收率在85.1％以上，RSD小于7.5％；方法简单，灵敏度高，可用于饲料中莱克多巴胺的含量测定。
　　关键词 莱克多巴胺； 残留； 饲料；高效液相色谱法
   
　　莱克多巴胺是苯乙醇胺类β2－肾上腺素兴奋剂，能促进动物体蛋白质沉积，抑制脂肪沉积，具有营养“再分配效应”[1,2]。因此，有人用来作为饲料添加剂，提高猪酮体的瘦肉率。但是，动物在饲用含莱克多巴胺的饲料后，会造成肌肉及组织中不同程度的残留，使用不当将导致消费者出现不同程度的中毒现象。为保障人民的身体健康和生命安全，保障畜牧业的健康持续发展，我国已经明确将其列入禁用药品目录。然而，在饲料或饲养过程中违法使用莱克多巴胺的现象已经出现，并有蔓延之势。
    由于莱克多巴胺是一种新型的β2－肾上腺素兴奋剂，目前的检测方法和检测标准很少[3,4]，特别是国内尚未见文献报道。因此探索饲料中莱克多巴胺的检测方法具有很重要的意义。我们比较了提取剂、提取方法、固相萃取柱、萃取试剂、流动相对提取效果的影响，在此基础上对HPLC测定方法进行了系统考察，即线性范围、重复性试验、稳定性试验、加标回收率等，最终确定了一套比较理想的检测条件。

　　1 实验部分

　　1.1 仪器与试剂
　　Waters 2695高效液相色谱仪；Waters W-474荧光检测器；PE LS-45型荧光分光光度计；KQ-500超声波振荡器；Sigma 2k15冷冻离心机；BüCHI B-490旋转蒸发仪；MS2 minishaker漩涡混匀器；METTLER AG-285电子天平；氮吹仪；SLA固相萃取柱（500mg/5ml），杭州富裕科技服务有限公司提供。
　　莱克多巴胺对照品；高效液相用乙腈为色谱纯，美国TEDIA；水为超纯水；戊烷磺酸钠为色谱级；其它试剂均为分析纯。
　　1.2 色谱条件
　　色谱柱类型Waters Symmetry C18柱，4.6mm×250 mm（i.d.），粒径5μm；流动相为戊烷磺酸钠溶液（取800ml水，加20ml冰醋酸和0.87g戊烷磺酸钠）∶乙腈(体积比80:20)；激发波长为226nm，发射波长为306nm；流速1ml／min；进样量50μl。
　　1.3 标准曲线的绘制
　　精密称取25mg莱克多巴胺对照品置于100ml棕色量瓶中，用甲醇溶解后定容，摇匀，为莱克多巴胺储备液。精密量取莱克多巴胺储备液1ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得莱克多巴胺工作液。分别准确吸取一定量的标准工作液，用2％乙酸溶液稀释、定容，配制成浓度为0.02μg/ml、0.04μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml的标准溶液，分别进行HPLC检测。
　　1.4 样品提取与纯化
　　称取饲料3.0g，准确加入2％氨/甲醇溶液25ml，涡旋振荡1min，超声振荡10min，5 000r/min离心5min，取上清液10ml至鸡心瓶中，50℃旋转蒸干。用2mL甲醇和2ml正己烷溶解鸡心瓶，重复一次，弃去上层；再加入2ml正己烷，重复一次，分出甲醇至10ml离心管中，45℃氮气吹干。用5ml乙酸乙酯溶解，加少量无水硫酸钠，5 000r/min离心3min。洗涤液过SLA固相萃取柱（先经5ml乙酸乙酯润洗）用50％乙腈/乙酸乙酯溶液3ml洗涤柱子，然后用50％甲醇/乙酸乙酯溶液5ml洗脱收集，氮吹至干。用2％乙酸溶液定容到1ml，过膜，上机。

　　2 结果与讨论

　　2.1 色谱条件的优化
　　由于莱克多巴胺的紫外最大吸收波长在224nm左右，如果用此波长作为检测波长，则杂质干扰很大。由于莱克多巴胺具有荧光吸收，故我们采用荧光检测器进行检测。结果表明激发波长为226nm，发射波长为306nm时，吸收最强。流动相为戊烷磺酸钠溶液与乙腈经一定的配比而成，通过调整配比，流动相为戊烷磺酸钠溶液∶乙腈体积比为80∶20时，莱克多巴胺的保留时间比较适合，避免了杂质峰的干扰。
　　2.2 线性关系与线性范围
　　将绘制标准曲线用莱克多巴胺工作液按浓度从低到高，依次进行高效液相色谱分析。按其所得峰面积与对应的工作液浓度作标准曲线图，并计算回归方程和相关系数。莱克多巴胺浓度与峰面积的回归方程为：y=10 080 548x+6 438，相关系数r=0.999 9，在浓度0.02～1.0ug/ml的范围内线性关系良好，图1为莱克多巴胺的标准曲线图。

　　2.3 净化条件的确定
　　2.3.1 不同固相萃取柱的比较
　　用于β－兴奋剂净化的固相萃取柱有硅藻土、C8、C18、硅胶、强阳离子交换柱和弱阳离子交换柱等, 本文对SLA、SLH、C18、硅胶、胺基5种SPE净化柱进行除杂及过柱回收率比较，结果见表1（添加量为5.0mg/kg）。
　　经过以上效果比较，选择SLA型SPE净化柱作为饲料中莱克多巴胺测定净化柱，样品甲醇提取物经过SLA柱净化后，可以较好的达到净化目的，且过柱回收率在90%以上。

　　2.3.2 固相萃取条件的确定
　　选用2ml甲醇和2ml正己烷溶解鸡心瓶，弃去上层，利用正己烷的脂溶性除去部分杂质，收到了较好的效果。氮吹至干后用5ml乙酸乙酯溶解，加少量无水硫酸钠，除去微量水，洗涤液过SLA固相萃取柱。用50％乙腈/乙酸乙酯溶液洗涤柱子，当洗涤液为3ml时回收率较高，而且杂质干扰较少。然后用50％甲醇/乙酸乙酯溶液洗脱收集，先用洗脱液为5ml洗脱；另取5ml洗脱液重复一次，同法检测未发现莱克多巴胺，说明5ml可以将吸附在柱子上的莱克多巴胺完全洗脱下来。故理想的洗涤液用量为50％乙腈/乙酸乙酯溶液3ml，洗脱液用量为50％甲醇/乙酸乙酯溶液5ml。