性控IVF胚胎的研究进展与产业化

一、我国奶牛业的现状和发展战略目标：

根据最近统计我国2002年奶牛总头数达到687.3万头（其中良种奶牛约200万头，占奶牛总头数29%），奶类总产1400.4万吨（其中牛奶1299.8万吨，占奶类总产量92.8%）。按378万头成年母牛计算（约占牛群55%），单产仅为3400kg，而美国以色列等国为8400kg，丹麦、法国、日本为6500kg以上，人均占有奶量世界为97.6kg，发展国家为50.9kg，我国为10.9kg，远远低于世界平均水平。

按中国食物与营养发展纲要（2001-2010年）要求，到2010年，全国平均奶类消费水平将达到16kg，其中城市居民将达到32kg，奶类产量安全保障目标为2600万吨，7年后奶类生产需增加1199.4万吨（其中牛奶约为1115.4万吨），每年平均增加奶类生产171.3万吨（其中牛奶159.3万吨），因此，要求我国的奶牛业必须快速发展。

奶牛资源不足，单产水平低，长期以来是制约我国奶业发展的主要因素，目前我国适繁母牛约占全群的55%左右，年繁殖成活率为80%左右，年正常淘汰率20%左右，年死亡率约为3%，且公犊及母犊的比例为1：1，客观规律限定我国每年奶牛头数的增长速度为10%左右。所以，依靠常规技术对现有奶牛群逐步发展或是不惜花高价从国外购进部份良种高产奶牛，是不可能超越常规速度达到快速发展的目的。而通过用良种奶牛精液对本地黄牛进行杂交改良，在20世纪80年代开展以来，对我国奶牛总头数和总产奶量较快的增长，起到一定的历史作用，但却造成我国总头数600万头的奶牛中良种荷斯坦牛仅有200万头左右，成年母牛单产近几年以来仅在3000公斤以上，每年按100-200公斤左右，缓慢增长的落后局面。这与国际在奶牛生产上，增长方式主要追求个体生产水平的提高，而不是奶牛数量的增加的发展途径差距极大。澳大利亚从1980年到2000年期间奶牛饲养头数增加18%，奶牛个体产量由2977kg增加到5088kg，牛奶总产量由556万吨增加到1117万吨，产奶量翻了一番。

因此，我国奶牛业若要达到快速发展，应在加快良种奶牛群的遗传改良速度的同时，必须打破常规，尽快应用国内外近几年取得的奶牛胚胎生物工程技术和良种公牛精子分离的性别控制技术的研究成果，以期达到奶牛群从数量和质量上同时提高的良性快速增长的目的。

二、性控IVF冷冻胚胎的研究进展

    利用北美高产奶牛屠宰后获得的丰富卵巢资源采集的卵母细胞，以及美国、加拿大在体外受精技术、精子分离技术、体外受精胚胎的冷冻技术等资源和技术优势，生产性控IVF冷冻胚胎及进行移植的试验研究已取得以下进展：

(一) 用流式细胞分离仪分离的精子进行体外受精试验

    据广西大学动物繁殖研究所张明、卢克焕在美国试验证明：用分离精子比用未分离精子对成熟后的卵母细胞进行体外受精，卵裂率降低（P<0.05）但囊胚率无显著差异(表I)。

表1  已分离及未分离精子受精后的卵裂率和囊胚率

    由此说明：分离精子过程及染料Hoechst 33342对胚胎发育没有影响，流式细胞分离仪分离的精子可以有效用于性控IVF胚胎生产。但据加拿大爱德集团在魁北克省的胚胎技术公司技术人员介绍，一头奶牛的一对卵巢的卵母细胞，用未分离的精子进行体外受精平均可获4枚商品IVF胚胎，而用已分离的X精子进行体外受精，平均仅获1枚商品性控IVF胚胎。

(二) 不同冷冻方法对性控IVF胚胎冷冻、解冻后的可用率

据美国和加拿大公司的研究人员提供的资料，用微滴玻璃化冷冻法，解冻后可用率为95%左右，而用0.25ml细管常规冷冻法，解冻后可用率为85%左右。

(三) 性控IVF冷冻胚胎达到的质量

在实验室应用PCR胚胎性别鉴定方法，对性控IVF胚胎抽样检测结果为雌性胚胎率95-96%，预计移植妊娠受体母牛的产母犊率可达到90%以上。解冻后可用胚胎率为85-95%，孵化率60%以上，移植妊娠率为35-45%，预计所产胚胎移植后代第一胎在科学饲养管理条件下，产奶量可达到8000kg以上。

(四) 不同冷冻方法性控IVF胚胎、解冻后移植试验

表2  不同冷冻方法性控IVF胚胎解冻后移植结果

微滴玻璃化的冷冻胚胎移植效果略高于细管常规冷冻法。

(五) 7天体外受精胚胎移植给发情后5-5.5天受体母牛的移植效果试验

从供体母牛采集的体内7天胚胎，由于黄体已形成并具分泌孕酮功能，所以需要移植给发情后7天的发情同期受精母牛，才能达到胚胎与子宫生理环境的一致性。而体外受精的胚胎，在7天体外培养发育的过程中，胚胎是在未添加孕酮的培养液中培养发育，所以，若与7天体内胚胎一样要求受体母牛也是发情后7天进行移植，可能影响体外受精胚胎移植成功率，若在受体母牛发情后5天—5.5移植7天体外受精囊胚，有可能提高移植妊娠率，据国内有关单位试验结果如下（表3）。

表3  体外受精囊胚移植发情后5-5.5天受体母牛试验

    初步试验说明，体外受精囊胚移植给发情后5-5.5天受体母牛，妊娠率可达到70%-75%，虽然移植试验受体母牛头数较少，但可以表明，在未添加一定浓度孕酮的培养液中培养7天发育为囊胚的体外受精胚胎，移植给发情后5-5.5天黄体刚开始具有分泌孕酮功能的受体母牛，可能更符合胚胎与子宫生理环境一致性的基本原则，从而提高IVF冷冻胚胎的移植成功率。

三、性控IVF胚胎的安全性

我国从美国和加拿大的性控IVF胚胎生产基地进口的性控IVF冷冻胚胎，严格按照我国和加拿大、美国动检部门已签订的生产IVF胚胎的兽医检疫协议，从屠宰场卵巢采集、实验室采集卵母细胞、卵母细胞成熟培养、体外受精、受精卵的体外发育培养、体外受精胚胎的兽医检疫处理、胚胎的冷冻和保存等系列技术操作过程均有严格的兽医检疫要求，并且必须通过国家动检部门的现场验收合格之后，性控IVF冷冻胚胎才能出口到我国，因此，性控IVF冷冻胚胎不易造成传染病的传播。

四、性控IVF胚胎的系谱

性控IVF胚胎从生产技术上，完全可以生产系谱明确的IVF胚胎，但必须将从每头母牛一对卵巢采集的卵母细胞单独进行体外受精过程的系统操作，造成生产效率降低，而生产成本提高。

我国目前的奶牛群与国际一些国家的奶牛群一样，既有系谱登记明确的种用牛群，也有大量系谱不太明确的商品牛群，因此，IVF胚胎生产单位，计划生产以下两种IVF胚胎：(1)生产公牛系谱明确的半系谱IVF胚胎，可以为胚胎移植后代选种选配时提供参考，以增加我国高产奶牛群的数量；(2)严格选择母牛和种公牛，生产父系、母系系谱均明确的全系谱IVF胚胎，所产胚胎移植后代，母犊可补充奶牛育种群，公犊可作为后备种公牛。

五、性控IVF胚胎在我国已形成产业化

奶牛胚胎移植产业化的具体体现应是：规模化、标准化的胚胎生产基地和能力；规模化、集约化的受体母牛饲养基地和胚胎移植技术力量；规模化、批量化的出生胚胎移植后代。

加拿大爱德现代牛业发展集团在加拿大魁北克省和美国宾夕法尼州分别建立奶牛IVF胚胎生产基地，基本上掌握北美高产奶牛的卵巢资源，自2003年9月建成后，购置流式精子分离仪，选择美国和加拿大每年排名前100名的部份优秀种公牛的精液进行分离，分离出的x精子用于生产性控IVF胚胎，每月具备规模化生产两万枚以上性控IVF胚胎能力。

在国内已在河北、河南、山东、湖北、新疆、甘肃、吉林、黑龙江等省分别与当地政府投资部门或企业合资建立和筹建十多个具有饲养3000头受体母牛规模的性控IVF胚胎移植产业化基地，计划到2004年年底饲养受体母牛总数将达到2.5万头左右，移植妊娠受体母牛2万头左右，初步形成性控IVF胚胎移植产业化，为我国奶牛业的发展，提供一条逐步提高以奶牛个体生产水平为主，而以逐步增加奶牛总头数为辅的胚胎生物工程技术与性别控制技术相结合的快速发展奶牛业的技术途径