马长书1，马巍2，杨前勇3
（1，3．公安部南昌警犬基地，2．南京农业大学动物繁育研究所）
摘要：AFLP（扩增片段长度多态性）技术因其无需了解待测DNA序列、高效且分辨率高、重复性好等特点已被应用于构建遗传图谱、遗传多态性分析、品种鉴定、疾病诊断等的研究中。本文介绍了AFLP技术的原理、方法、特点、技术关键，阐述了AFLP在犬育种中的应用前景。
关键此：AFLP；犬；应用前景
Abstract: AFLP（amplified fragment length polymorphism）can generate fingerprints of any DNA without much prior sequence knowledge. Data produced by AFLP are highly efficient, highly differentiate and reproducible. So it has been used in the construction of linkage genetic maps, analysis of genetic polymorphism, identification of breed and disease diagnosis. The principle, methodology, trait, key of technique and application prospect in canine breeding were induced in this paper.
Key words: AFLP ; canine ; prospect of application
AFLP（amplified fragment length polymorphism.扩增片段长度多态性）是在RAPD和RFLP标记系统基础上发展起来的分子标记[1]，是由Zabeau Marc和Vos Pieter于1992年创立[2]，于1993年获欧洲专利局专利（专利号EP0534858AI）。该技术首先运用于植物分子生物学的研究中[3]，但因在操作过程中其不需要了解待测DNA序列、快速、高效,且分辨率高、重复性好、易于标准化等特点很快被推广到生物学的各个领域，如遗传图谱的构建、遗传多样性和系统发生、基因或基因组区域特异性标记的筛选和定位、细菌鉴定以及疾病诊断和肿瘤等方面的研究[4-8]。
1．AFLP的原理和方法：
AFLP是通过DNA多聚酶链式反应(PCR)扩增基因组DNA的模板而产生。DNA多聚酶利用一段引物以解链后的单链DNA为模板,沿着5′到3′方向把核苷酸连续加在延伸的3′羟基上复制DNA。由于不同物种或不同品种的基因组DNA大小不同,对引物所诱导复制的特定DNA片段采用PCR技术进行扩增,然后用电泳方法将扩增的DNA片段分离,即可使某一品种出现特定的DNA带谱(即扩增片段长度多态性),而在另一品种中可能无此谱带产生,因此这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记, 即AFLP标记。
AFLP技术包括三个步骤[9]：①用密切酶和稀切酶两个切割频率不同的限制性内切酶消化基因组DNA，然后在切口处连接含相同内切酶位点的“接头”(Adapter);②选择性扩增酶切片段,根据接头设计引物,AFLP的引物包括与人工接头互补的核心序列(CORE)、限制性内切酶识别序列(ENZ)和3′端选择性碱基三部分。扩增时一般采用两步法,首先用单选择碱基的引物进行预扩增反应,预扩增产物稀释后用2—3选择碱基选择性扩增。采用两步法的优点是可以提高扩增特异性,降低AFLP图谱的弥散背景，可使扩增带数减少，从而使产生的指纹图谱更清晰和具有更好的重复性，再者是提供大量的模板DNA。,;③扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。检测基因组因限制性酶切位点、选择性碱基结合位点所发生的碱基突变、插入、缺失或替换而产生的扩增片段有无多态,或因两选择性引物结合位点区域间存在碱基插入或缺失而导致的扩增片段长度的多态。在不需要事先知道DNA序列信息的前提下,就可对酶切片段进行经典的PCR扩增。
2．AFLP的特点
AFLP综合了RFLP和RAPD技术的优点，可检测到分布于全基因组上的DNA片段。AFLP技术虽诞生的时间很短,但由于其独到的检测DNA多态性的方式,已成为基因组研究的非常有用的工具,备受遗传学家和分子学家的青睐,应用范围越来越广泛,其独特的优点有：①AFLP同RAPD一样,不需要预先知道所要扩增DNA的序列,适合对遗传背景不多和基因组研究不充分的种类进行分析。不论来源和复杂性如何,任何DNA都可得到AFLP的指纹图谱；②具有一定的灵活性,可通过特异性PCR引物的设计和内切酶组合的选择以及选择性扩增碱基的数目去控制AFLP图谱中条带的数量;③ 多态性强，分辨率高。AFLP技术是针对整个基因组的,因此可同时对随机分布在染色体上的许多不同的DNA区域多位点进行分析，而且AFLP可获得高密度标记与其它遗传标记相比,AFLP具有最高的信息含量(许占友等,2000)。这些AFLP标记中至少有部分标记位于变异的区域,因此可以展示种群内微小的遗传变异,并可以用测序凝胶来区分AFLP扩增带间的单个核苷酸的差异；④重复性好， AFLP需高质量的DNA和过量的酶可以克服因DNA的酶切不完全而产生的失真,特异性的PCR引物、两步法的扩增和较高的退火温度（56℃）将误差减少到最低限度。Jones等[10]用AFLP探针在欧洲8个不同的实验室之间进行检测,发现其错误率小于0 6%。
但AFLP也有其自身的缺点：①AFLP是一种专利技术,受专利权保护，实验成本和造价比较高,特别是4碱基限制性内切酶的价格十分昂贵; ②AFLP对基因组DNA的质量有较高的要求,不能含内切酶的抑制剂（蛋白质、残留酚、多糖等）,因为AFLP要求基因组DNA完全酶切,如果酶切和连接不完全可能会扩增出被认为是多态性的带,导致错误的分析结果。③由于目前对基因组、特别是复杂基因组的认识程度还十分有限，这使内切酶/引物的选择和设计上出现了一定的盲目性；④AFLP产生的标记多数是显性的, 其多态的统计是基于酶切片段的有无，因此不能区分某一位点是杂合体还是纯合体。与共显性标记相比,不能更好地估算种群遗传的变异。另外AFLP为匿名标记，不知其染色体的分布情况[11]。
3．AFLP的技术关键
3．1 限制性内切酶的选择
限制性内切酶的选择对AFLP分析的准确度具有关键性作用,AFLP分析可以采用的酶有许多种,包括EcoRⅠ、HindⅢ、ApaⅠ、TagⅠ、MspⅠ、HpaⅡ、MseⅠ、PstⅠ等。EcoRⅠ可靠、高效而价廉,是六碱基内切酶(稀切酶)的首选酶类；四碱基内切酶（密切酶）,在分析富含—AT序列的植物和微生物基因组时大多选用MseI,因为MseI的识别序列为TTAA。不过,对动物基因组进行AFLP分析时常用TaqI取代MseI,因为在动物基因组中,GC双碱基序列属高度多异区,多态性丰富,而TaqI的识别位点(TC-GA)含GC双碱基序列,可获得更多的AFLP多态标记,但是也有报道HindⅢ适合G＋C含量为40～50%的基因组[12]。
3．2 接头（adapter）和引物
接头是人工合成的一段短核苷酸双链，由核心序列（core sequence）和酶化序列（enzyme specific sequence）两部分组成。接头的设计除了与相应的酶相匹配外，还应遵循以下原则：①具有合适的GC含量，限制性片段与对应接头连接后要保证原限制性内切酶位点不得恢复；②接头不被磷酸化，这样可以避免接头与接头间的连接。
引物的设计是PCR扩增的关键,而引物设计主要在选择碱基数目及组合上。AFLP的引物长度一般为16～20个碱基，选择性延伸部分有1～3个核苷酸组成，在这个范围内每增加一个选择性核苷酸可以使扩增条带减少到原有条带的1/4[13]。具体的选择碱基数目取决于所研究物种基因组的大小,微生物基因组较小,多采用一个选择性核苷酸；105～108bp基因组可以用2个选择性核苷酸；大于108bp的基因组可以用3个选择性核苷酸。对于选择性核苷酸的组合，基因组中G＋C含量基因组其选择性引物3’选Ａ或Ｔ,反之,可选Ｃ。AFLP引物的另一个重要特征是所有引物5’端是G碱基,它可以有效防止双链形成[14]。
4．AFLP在警犬研究中的应用前景
从进化角度看，人、鼠和狗曾拥有共同祖先，人类与狗基因组之间约有6.5亿个碱基对部分相同，在已识别出的2.4万多个人类基因中，至少有18473个与狗的基因相同。据估计，狗身上有360多种遗传疾病与人类疾病相似。因此对犬基因组的测定与分析不仅对犬的育种和遗传疾病的研究与防治有促进作用，而且也为人类自身的遗传疾病提供了最直接的模型。美国国家人类基因组研究所（NHGRI）2002年9月宣布，犬、牛和一种纤毛虫已被列入基因组需要测序的高优先级生物官方注册名单。AFLP作为一门新兴分子标记技术，目前虽未见其应用于犬基因组研究的报道，但AFLP在微生物、植物和其他动物方面的应用给予我们提示。
4．1 构建遗传图谱和QTL定位
AFLP技术可以用于未知基因组的多态标记，而且可以缩小特征基因与连锁标记之间的距离，增加染色体末端标记和填充RFLP空隙,不干扰RFLP标记簇[15.16]。荷兰Keygene公司Pot Jerina构建了拟南芥高密度的遗传图谱，共700余个AFLP位点覆盖了拟南芥的整个染色体组[17]。Tan等(2001)用AFLP技术构建家了蚕的连锁遗传图谱。他们用35个引物组合获得了1248(60.7%)条多态带分配在30个连锁组,长度在37.4～691.0cM，连锁图谱总长度为6512cM[18]。Otsen等[16]在小鼠的连锁图谱上定位了18个AFLP标记,并研究了RⅠ家系中的一些血压显型与AFLP标记基因型的关系,将两个相关的AFLP标记定位在20号染色体上。Thomas利用AFLP和混合分离分析（Bulked Segregation Analysis, BSA）法获得了42000个AFLP位点，并从中找出3个与番茄cfg抗性基因共分离的AFLP标记[19]。Plastow G S等（1998）通过420对AFLP引物检测到13个可能与猪毛色基因相关的标记，其中COLI标记与毛色基因Ⅰ显著连锁不平衡。
4．2 遗传多样性分析和品种鉴定
AFLP法构建的指纹图谱具有多态性强、重复性好、灵敏度高的优点, AFLP还能区别很小的遗传差异,如鉴定整条染色体上相差仅一单链小片段的大豆近等位基因[20],。因此，AFLP在分析亚种水平的遗传变异,尤其是测定种群结构和分化、品种鉴定方面得到最广泛的应用。曹少先、杨利国等用29个AFLP引物组合分析了3个山羊品种，共扩增出3253个标记，其中可变标记92个。并对三个品种的山羊作聚类分析。梁智勇等应用25个单酶切引物和25对双酶切引物对10个品系小鼠进行分析，共得到467个多态位点很好的区分了遗传背景或外观形态很相似的品系[21]。任军、黄路生等利用12对AFLP引物组合检测了19个中国地方猪种(群)、1个培育猪种和4个欧美引进猪种混合基因组DNA的遗传变异。结果表明, AFLP标记有着很高的多态检测效率(Ai),平均每个引物组合检测到17.3个多态标记,非常适合于猪种(群)遗传多样性分析和品种鉴定[11]。PAJmone,Marsam用16个AFLP引物组分析了意大利Fresian牛群47个体的遗传多样性。结果表明,AFLP标记的多位点性、很好的稳定性和重复性使得该技术非常适于分析动物基因组,检测生物多样性[22]。
4．3 疾病与疾病诊断
现有的犬品种都不同程度的携带遗传疾病，例如约有10%的爱尔兰赛特猎狗携带一种可引起免疫疾病的基因；德国牧羊犬有132种易患的遗传疾病，涉及了骨骼、视觉、皮肤、心血管、神经、消化系统并且遗传模式和发病年龄都有很大差异[23]。 通过DNA检测避免该基因携带者参与交配可以较好的预防遗传疾病。目前，AFLP差异筛选技术被广泛地应用在肿瘤研究方面。Fukuda等[8]利用AFLP技术分析了小鼠可转移的骨肉瘤cDNA,克隆得到4个与骨肉瘤高转移性状连锁系列的基因；Majima等[24]将一种改进的AFLP技术运用到从Tsc2基因突变致发肾脏肿瘤的小鼠中分离不同表达的基因,一种命名为“rising dbl quote , left (low) Niban”的基因被选作进一步的研究。同样AFLP技术还被用于骨髓移植嵌合现象的监控[25]。
结语：
AFLP技术由于具有多态性强、分辨率高、重复性好等优点，已广泛用于遗传图谱构建、遗传多态性分析、品种鉴定等，但作为一种新兴的分子标记技术还存在着缺陷，AFLP技术受到其共显性性质的限制,不能象微卫星和等位酶技术那样清晰地进行种群遗传学分析。AFLP技术与微卫星、DNA测序等技术的结合将更好的发挥作用。
参考文献：
[1] VosP,Hogers R, BleekerMetal.AFLP:a new technique for DNA finger printing .Nucleic Acids Research,1995,21: 4407～4414.
[2] Zabeau M, Vos P. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA finger printing[P]. European Patent Office Publication 1993,0535858AI.
[3] Zabeau M, Vos P. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA finger printing[P]. European Patent Office Publication number:92402629.7,1993. Publication number EP0534858.
[4] Becker J, Vos P, Kuiper M, et al. Combined mapping of AFLP and RFLP markers in barley. Mol Gen Genet, 1995,249(1):65～73.
[5] Otsen M, denBieman M, Kuiper MT, et al, Use of AFLP markers for gene mapping and QTL detection in the rat. Genomics,1996,37(3):289～294.
[6] Rademarker JL, Hoste B, Louws FJ, et al. Comparison of AFLP and rep-PCR genomic finger printing with DNA homology studies: Xanthomonas as a model system. Int J Syst Evol Microbiol,2000,50(Ｐｔ2):665～677.
[7] Velappan N, Sondgrass JL, Hakovirta JR, et al. Rapid identification of pathogenic bacteria by single enzyme amplified fragment length polymorphism analysis[J] . Diagnostic Microbiology and Infections Disease 2001,39:77 83.
[8] Fukuda T, Kido A, Kajino K, et al. Cloning of differentially expressed genes in highly and low metastatic rat osteosarcomas by a modified cDNA AFLP method. Biochem Biophys Res Commun,1999,261(1):35～40.
[9] Lin JJ, Kuo J, Ma J, et ail. APCR based DNA fingerprinting technique: AFLP for molecular typing of bacteria[J]. Nncleic acids Research 1996,24(18):3649 3650.
[10] Jones CJ. Reproducibility testing of RAPD,AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories. Mol Breed,1997,3:381～390.
[11] 任军,黄路生,,艾华水等. 24个中外猪种(群)的AFLP多态性及其群体遗传关系. 遗传学报,29(9):774～781,2002
[12] Janssen P, Coopman G, Huys J, et al. Evaluation of the DNA finger printing method AFLP as a new tool in bacterial taxonomy[J]. Microbiology 1996,142:1881 1893.
[14] VosP,Hogers R, BleekerMetal.AFLP:a new technique for DNA finger printing .Nucleic Acids Research,1995,21: 4407～4414.
[15] Powell W, et al. Heredity, 1997,79:48～59.
[16] Otsen M, denBieman M, Kuiper MT, et al, Use of AFLP markers for gene mapping and QTL detection in the rat. Genomics,1996,37(3):289～294.
[17] International plant genome conference Ⅵ January,1996. San Dioge, USA||San Dioge, USA
[18] Tan Y D, Wan C, Zhu Y, Lu C, et al. An amplified fragment length polymorphism map of the silkworm. Genetics, 2001157(3):1277-1284.
[19] Thomas C M, Vos P, et al .Identification of amplified restriction fragment polymorphism(AFLP) markers tightly linked to the tomato cf9 gene for resistance to cladosporium fulvum .The Plant Journal , 1995,8(5) :785～794
[20] Maughan P ,et al .Theor Appl Genet, 1996,93:392～401.
[21] 梁智勇,史景泉等. 10个品系小鼠的AFLP分析. 第三军医大学学报,2003,1(25):155～159
[23] Judy Huston. Canine Genetic Diseases Affecting The German Shepherd Dog
[24] Majima S, Kajima K, Fukuda T, et al. A novel gene “niban” up regulated in renal carcinogenesis: cloning by the cDNA amplified fragment length polymorphism approach. Jpn Cancer Res, 2000,91(9):869～874.
[25] Schreiner T, Prochnow Calzia H, Maccari B, et al. Chimerism analysis after allogeneic bone marrow transplantation with nonradioactive RFLP and PCR AFLP using the same DNA. J Immunol Methods, 1996,196(1):93～96.